利用酵母双杂交技术筛选介体灰飞虱中与水稻条纹病毒病害特异蛋白互作的蛋白质

【目的】筛选介体灰飞虱（Laodelphax striatellus,SBPH）中与水稻条纹病毒（RSV）病害特异蛋白（disease-specific protein,SP）可能发生相互作用的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制及SP在传毒过程中的作用打下基础。【方法】提取高质量灰飞虱总RNA并通过TaKaRa D9086 OligtexTM-dT30 mRNA Purification Kit对mRNA进行纯化。利用SMART技术合成双链cDNA,利用Axygen的PCR纯化回收试剂盒将ds cDNA回收纯化,纯化后的ds cDNA再经SfiⅠ限制性内切酶处理纯化后与文库载体pPR3-N相连接以构建高质量灰飞虱cDNA文库,通过电转化的方法对灰飞虱cDNA文库进行扩增并进行cDNA文库质量和滴度检测。设计带有SfiⅠ酶切位点的引物以扩增得到目的基因即RSV SP。将带有酶切位点的SP基因序列连接到载体pDHB1上构成诱饵载体pDHB1-SP。将诱饵载体pDHB1-SP转化酵母菌NMY51中并提取总蛋白,通过Western Blot方法检测诱饵载体上的目的基因SP是否表达,并通过功能验证试验验证诱饵载体是否适合本研究采用的分裂泛素酵母双杂交系统。确定构建的诱饵载体适合本系统后,用诱饵载体与文库质粒pPR3-N共转化到酵母菌NMY51中以优化cDNA文库筛选条件并明确3-AT浓度。对灰飞虱cDNA文库进行筛选并对筛选结果进行分析,对筛选出来的蛋白进行体内试验以进一步验证是否发生互作。【结果】提取到高质量的灰飞虱总RNA,通过SMART技术合成的ds cDNA大小介于0.1-4.5 kb。构建的灰飞虱cDNA文库的库容量超过1.2×106 cfu,文库滴度为1.12×108 cfu/mL,扩增文库插入片段平均长度大于1.5 kb。载体酶切验证表明诱饵载体pDHB1-SP成功构建;Western Blot结果表明诱饵载体pDHB1-SP能够在NMY51中正常表达;功能验证表明诱饵载体pDHB1-SP适合该系统。在3-AT浓度为20 mmol?L-1的筛选条件下从构建的高质量的灰飞虱cDNA文库中筛选得到534个克隆,经测序、Blast比对最终得到76个可能与RSV的SP发生互作的灰飞虱蛋白质。根据SP在灰飞虱体内的亚细胞定位结果以及通过gene ontology(GO)对蛋白质的功能分析,挑选出20个蛋白质进行共转和β-galactosidase检测,结果表明这20个蛋白质均与RSV SP互作。【结论】通过构建高质量灰飞虱cDNA文库及酵母双杂交技术,筛选出了与RSV SP互作的蛋白质,为明确介体灰飞虱传播RSV的分子机制,及RSV的SP在传毒过程中的功能打下了基础。     

一种基于PCR技术混合样本高效定性筛查转基因阳性样本的方法

【目的】基于PCR技术与DNA样本混合策略建立一种高效定性筛查大量待检样本中转基因阳性样本的方法。【方法】以480个样本为研究案例,对待检样本DNA模板随机编号后构建虚拟三维混合池,置于5×96孔板中,将各板、各行和各列分别混合,构建所有板各行的X维行池（A,B,C,……G,H）和所有板各列的Y维混合池（1,2,3,……11,12）,各板所有样本混合的Z维混合池（I,II,III,IV,V）。利用三维交叉唯一性原理与PCR检测的灵敏性与特异性,高效定性筛查样本中的阳性个体。将浓度为500 ng•µL-1的阳性对照分别用ddH2O和同浓度阴性DNA模板进行96倍（96×）稀释,检测该方法的灵敏性与特异性。5×96孔板480个样本中,双盲法随机掺入13个Bt176转化事件标准样本（Cry1Ab阳性与Bt176特异引物阳性）,通过对25个混合池检测,得到候选阳性样本,并进行二次检测,筛查出真正的阳性样本。【结果】96×混合样本未影响检测的灵敏性与特异性。通过该种混合池得到可能的33个候选样本,再对33个候选样本进行二次检测,成功检测出所有与设置相符的盲样,即掺入的13个阳性样本。【结论】该方法适用于从大量的样本中用PCR方法定性筛查少量阳性样本的检测,工作量比普通单样本逐一检测的方法降低了80%左右。     

山羊痘暴发与防治

2002年8月,宣州区某羊场暴发了一起山羊痘,共发病112只,发病率为60%,死亡8只,死亡率7.10%.经采取综合防治措施,疫情得到了控制.     

肉鸡腹水症与大肠杆菌合并症的诊治

2003年6月．宣城市宣州区某养鸡场饲养的近5000羽肉鸡．从22日龄至33日龄陆续发病。发病率达60％以上．死亡率达40％．病程约2～4天。发病后用青霉素、链霉素拌料,恩诺沙星饮水均无明显疗效．经临床诊断与实验室检查,确诊为肉鸡腹水症与大肠杆菌合并症。     

肉鸡腹水症与大肠杆菌合并症的诊治

2003年6月,宣州区金坝乡某养鸡场饲养的近5 000羽肉鸡,从22～33日龄,陆续发病,发病率达60%以上,死亡率达40%,病程约2～4天.发病后用青霉素、链霉素拌料,恩诺沙星饮水均无明显效果,经临诊与实验室检查,诊断为肉鸡腹水症与大肠杆菌合并症.     

不同灌木柳的扦插成活率和光合特性比较

编织柳品种单一,柳条产量和质量低下是沿淮地区柳编产业发展的瓶颈。引进11个灌木柳新无性系,在沿淮低湿地上进行栽培试验,并对其成活率和光合性状进行调查比较。结果表明,引进的无性系P716、2344、2372的扦插成活率均在90%以上,可以作为淮河低湿地杞柳栽培的后备资源或育种材料加以选择。在光合特性方面,无性系1050、51-3、9-6和P716的净光合速率均达到45μmol/(m2.s)以上,明显高于本地种,具有较高的生长潜力。通过初步的综合判断,无性系P716和51-3在沿淮低湿地具有极好的适应性和生长表现。     

鸡球虫病的防治要点

<正> 球虫病是鸡的一种常见病,凡是有养鸡的地方,就会有球虫病的存在和发生。本病的发生除造成鸡只死亡等直接经济损失外,还会导致饲料报酬降低和继发其他疾病。笔者根据多年实践,结合球虫病的防治需要,就如何制定有效的防治措施,谈几点看法: 1.主动预防 多数抗球虫药主要抑制球虫内生性发育的无性生殖阶段,因此在生产实践中必须早期投药,以主动预防该病的发生。平时预防球虫用药,一般采取按比例拌入饲料中饲喂,尤其是使用比例较少的某些药物,如杜球,投喂前必     

家禽免疫接种失败原因的探讨

当前,在防制禽类主要传染病的综合措施中,免疫接种是一项重要手段,但免疫接种的失败现象屡见不鲜.现将造成免疫接种失败的主要原因,归纳分析如下:     

饲料着色剂加丽素红对鸡血清蛋白的影响

研究加丽素红对鸡血清蛋白的影响,为科学评价加丽素红的使用安全性提供依据。根据体重对等原则,将120只健康的19周龄海兰蛋鸡随机分为对照组(0g/kg)、低剂量组(0.08g/kg)和高剂量组(8g/kg)3组。首先饲喂添加不同剂量加丽素红的试验饲料30d,之后改喂基础饲料至60d,分别在10、20、30、40、50、60、70、90d于颈静脉采血,采用SDS-PAGE分离鸡血清蛋白,并利用凝胶成像系统进行扫描定量。结果表明,饲喂添加加丽素红饲料的海兰蛋鸡血清中的4种血清蛋白α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白和血清白蛋白随饲喂天数的增加,不同剂量产生不同程度的差异变化,加丽素红对鸡血清蛋白的合成有影响。     

硫化氢对大豆铝胁迫耐受性的增强作用

铝毒害是酸性土壤地区制约农作物生产的主要逆境因子。为明确作物抵抗铝毒害的机制,以大豆为试验材料,研究了新型植物气体信号分子硫化氢(H_2S)在铝胁迫耐受性中的调节作用。结果显示,铝胁迫处理诱导大豆根尖H_2S的产生。添加外源H_2S供体处理显著缓解了铝胁迫诱导的根伸长受抑,以及根尖铝含量、根尖细胞死亡率、根尖丙二醛和活性氧(H_2O_2和O■)含量升高,而添加H_2S合成抑制剂处理则产生了相反的效应,加重了铝胁迫对大豆的伤害;进一步研究显示,铝胁迫下添加H_2S供体处理增强了根尖抗氧化酶(APX、CAT、POD、SOD)的活性,而添加H_2S合成抑制剂处理则抑制了抗氧化酶活性的增强。表明铝胁迫下H_2S通过提高根尖抗氧化能力来清除活性氧的过量积累,缓解铝胁迫对根伸长的抑制。