一株灰葡萄孢黑色素缺失突变体的获得及其生物学特性

黑色素是许多植物病原真菌致病因子,为明确灰葡萄孢黑色素在致病及抗逆过程中的作用,本试验采用PEG介导的原生质体转化的方法获得了1个黑色素缺失突变体,并通过基因扩增及分子杂交对其进行鉴定。对突变菌株的致病力进行测定,结果显示突变菌株的致病力明显下降,并且与野生型相比突变菌株的生长速度下降和对紫外线敏感性加强。说明黑色素在灰霉致病性及抗逆中起关键作用,这为今后以灰霉黑色素为靶位点设计杀菌剂进行防治奠定了基础。     

磷脂酶C特异性抑制剂U-73122对玉米大斑病菌分生孢子萌发及毒素活性的影响

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)通过降解细胞膜上的磷脂分子产生IP3和DAG两个第二信使分子,分别激活下游的Ca2+途径和蛋白激酶C。研究表明,PLC与植物病原真菌的致病及发育过程有关。利用PLC特异性抑制剂U-73122初步研究了玉米大斑病菌PLC的功能。结果显示,U-73122对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,U-73122也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PLC可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。     

番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与X-75菌株鉴定

采用琼脂平板扩散法筛选对番茄灰霉菌具有拮抗作用的细菌,经过对200株分离自土壤的细菌菌株进行初筛、复筛后,得到了1株具有较高拮抗活性的菌株X-75。对该菌株进行形态观察和生理生化特征分析,初步将其鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),将其16SrDNA序列与GenBank中已知标准菌株的16SrDNA序列进行比对,并用Neighbor-joining方法构建X-75菌株进化树,结果表明,X-75与标准菌株AB245422 Bacillus velezensis聚于同一分支,同源性最高,达99.93%;利用番茄离体叶片对X-75菌株的防效进行初步检测,结果表明X-75菌株对番茄灰霉病菌具有明显的拮抗作用。     

玉米内生细菌YY1菌株高产抗菌物质的发酵条件优化

玉米内生细菌YY1菌株为枯草芽孢杆菌,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)有强烈的拮抗作用,通过产生抗菌物质发挥抑菌活性。以培养基的无菌滤液对玉米大斑病菌的拮抗活性为检测指标,确定其产生抗菌物质所需要的最佳碳源、氮源及无机盐,通过正交试验得到该菌株产生抗菌物质的培养基配方,并对其发酵工艺条件进行优化。结果表明,最佳培养基为可溶性淀粉3.0%,蛋白胨2.0%,KH2PO40.02%,MnCl20.01%。发酵工艺参数优化结果为培养基装液量30 mL/250 mL,接种量4%,培养基初始pH值为9.0,28℃条件下、120 r/min摇床振荡培养48 h。经发酵条件优化后,其抗菌活性有显著提高。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

2A型蛋白磷酸酶对玉米大斑病菌菌体发育的调控作用

【目的】明确2A型蛋白磷酸酶（PP2A）在玉米大斑病菌致病过程中的作用,为研发新型杀真菌制剂和探讨植物病害防治新策略奠定理论基础。【方法】利用不同浓度的PP2A特异性抑制剂——斑蝥素（cantharidin）处理玉米大斑病菌,研究在该抑制剂作用下玉米大斑病菌的菌落生长、分生孢子产量、孢子萌发、附着胞发育、黑色素合成及HT-毒素活性。【结果】随着斑蝥素浓度的增加,其对菌丝体生长的抑制作用也逐渐增强,当达到160 μmol•L-1时,培养8 d的菌落平均直径仅为对照的41.7%;同时,处理组产孢量均高于对照组,160 μmol•L-1斑蝥素处理组产孢量达到了对照组的15.5倍。分析斑蝥素对病菌分生孢子的萌发、附着胞形成及侵染的影响表明,上述3个阶段对斑蝥素的敏感性由强到弱依次为附着胞形成>分生孢子萌发>附着胞侵染;此外,对照组的胞内黑色素含量为0.13 g•L-1,处理组的胞内黑色素含量均高于对照组,且随着斑蝥素浓度的增加不断升高。【结论】PP2A特异性抑制剂斑蝥素对玉米大斑病菌菌落生长、附着胞发育具有抑制作用,而对分生孢子产生及胞内黑色素的合成具有一定的促进作用。     

玉米大斑病菌的胞外黑色素种类及影响其产量的因素

【目的】对玉米大斑病菌胞外黑色素的种类进行确定,探索影响玉米大斑病菌野生型菌株胞外黑色素产量的因素。【方法】利用酸碱沉淀法提取玉米大斑病菌01-23（野生型）菌株和1,3,8-三羟基萘还原酶（3HNR）基因缺失突变菌株ΔSt3hnr-3的胞外黑色素,采用红外光谱分析确定黑色素的种类。通过在培养基中添加不同的物质,确定影响胞外黑色素产量的因素。【结果】玉米大斑病菌胞外黑色素不同于DHN黑色素,2种黑色素的理化性质相似,溶解于热碱溶液,且与FeCl3反应产生沉淀。在振荡培养条件下,加入酪氨酸和三环唑分别使胞外黑色素的产量提高了2倍和1.5倍,而Cu2+浓度低于0.5 μmol•L-1利于胞外黑色素的合成,反之则表现抑制作用;pH值为6时较利于对胞外黑色素分泌。【结论】玉米大斑病菌胞外黑色素为DOPA黑色素类型,酪氨酸和三环唑对胞外黑色素的产生具有明显促进作用。     

玉米内生芽胞杆菌的抗菌活性物质及其拮抗玉米大斑病菌机理的初步研究

为了研究生防菌株对玉米大斑病菌的抑菌作用,深化对生防菌抗菌机制的认识,本研究从玉米(Zea mays)植株体内分离拮抗玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的内生细菌,对其抗菌物质及其抑菌机理进行初步研究。结果表明,所分离的内生菌株YY1经形态学观察、生理生化测定及16SrDNA序列分析,鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。菌株YY1发酵液的硫酸铵沉淀物具有抑菌活性,且在硫酸铵50%饱和度时抑菌活性最强,说明YY1菌株产生的抗菌活性物质可能是蛋白类物质。该菌株及其蛋白粗提液均对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)等7种植物病原真菌有较强的拮抗作用。用蛋白粗提液处理菌丝、分生孢子、原生质体后经显微观察发现,大斑病菌的基内菌丝由丝状畸变为串珠状,当蛋白粗提液浓度为0.78μg/μL时,可完全抑制分生孢子萌发,并导致原生质体裂解。通过抑制孢子萌发过程中信号途径相关基因的半定量RT-PCR分析和玉米大斑病菌不同信号途径相关基因突变体的抑制率统计,初步判定该抑菌过程主要通过cAMP信号转导途径发挥作用。本研究为寻找玉米大斑病菌新的防治方法和途径提供基础资料。     

两种溶氧条件下亚硝酸盐和氨氮对罗氏沼虾毒性比较的研究

为了解溶氧对水中亚硝酸盐和氨氮毒性的影响,利用罗氏沼虾作为试验动物进行了正常溶解氧和高溶解氧条件下亚硝酸盐和氨氮的毒性试验。结果表明,正常溶氧条件下,亚硝酸盐对罗氏沼虾的48hLC50值和96hLC50值分别为75mg/L和43.87mg/L,非离子氨对罗氏沼虾的48hLC50值和96hLC50值分别为1.5mg/L和0.83mg/L;而高溶氧条件下亚硝酸盐对罗氏沼虾的48hLC50值和96hLC50值分别为86mg/L和62.64mg/L;非离子氨对罗氏沼虾的48hLC50值和96hLC50值分别为2.13mg/L和1.425mg/L。高溶氧条件下亚硝酸盐与非离子氨96h的安全浓度值为正常溶氧条件安全浓度的1.43倍和1.76倍。高溶氧可以明显地降低亚硝酸盐和非离子氨对罗氏沼虾的毒性,在水产养殖过程中通过提高水体溶氧水平可以降低水质污染对养殖对象的危害,提高经济效益。     

灰葡萄孢产孢缺陷菌株的遗传分析

本研究从400余株灰葡萄孢ATMT转化子中筛选到产孢缺陷菌株BCG-183.利用CTAB法提取野生型和BCG-183的基因组DNA,Southern杂交证实T-DNA标记在突变菌株中为单拷贝插入;对该菌株表型进行分析,发现BCG-183菌株菌落呈白色,菌丝产量较野生型大;致病性较野生型强;利用血球计数板计算产孢量,表明...