杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。     

两株草鱼源维氏气单胞菌菌株的主要表型特征及致病力比较

维氏气单胞菌(A.veronii)是严重危害草鱼的一种病原。本研究从电镜观察、Biolog微生物自动分析仪鉴定、细菌游动能力、胞外产物活性、细胞黏附性、对草鱼致病力和毒力基因等方面,比较草鱼源A.veronii菌株GZ09007和FS12001的表型特征和致病性差异。结果显示,两株细菌菌体均呈短杆状或弧形、两端钝圆,在透射电镜下可见单鞭毛。Biolog微生物自动分析仪鉴定结果显示菌株均为A.veronii,两株细菌均具有游动能力,胞外产物具有溶血活性、溶蛋白活性和脂肪酶活性,但GZ09007的游动能力、溶血活性、蛋白酶活性均显著强于FS12001 (p<0.05)。GZ09007对EPC、CIK细胞黏附性弱,FS12001的细胞黏附性强,两株细菌的细胞黏附性差异显著(p<0.05)。菌株GZ09007具有aerA、act、lip、ser、exu、fla毒力基因,但未检测到ast、alt、gcaT、ahyB等毒力基因;菌株FS12001具有aerA、act、alt、ast、lip、ser、ahyB、exu毒力基因,但未检测到gcaT、fla毒力基因。两株细菌均可以造成草鱼发病死亡,GZ09007对草鱼的LD₅₀为5.6×10~6cfu,而FS12001的LD₅₀则高于1.5×10~8cfu。表明GZ09007为强毒株,FS12001为弱毒株。推测A.veronii胞外产物的溶血活性和溶蛋白活性在其感染和致死草鱼过程中起到了关键作用。本研究结果为进一步探究A.veronii菌株的致病机理提供依据。     

锦鲤疱疹病毒病的传入风险评估

锦鲤疱疹病毒病(KHVD)自1997年首次报道以来,在全球多个国家传播流行,给鲤鱼及锦鲤养殖业造成重大经济损失。我国是鲤鱼养殖和贸易大国,KHVD严重威胁着我国鲤鱼的健康养殖。本文分析了KHVD在全球的流行分布情况和不同地区的病原差异,并在此基础上评估了病毒跨界传播的风险,预测了KHVD的流行形势,提出了相应的防控建议,为我国KHVD防控措施的制定提供了参考。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析

为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5.抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为K链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应.选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子.本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础.     

剑尾鱼脑细胞系的建立及细胞色素P4501A的诱导表达

为了构建剑尾鱼脑细胞系并探讨其细胞色素P4501 a(CYP1A)基因的诱导效应,实验通过胰蛋白酶消化法对剑尾鱼脑组织进行体外培养,经连续继代培养,建立了可稳定传代的脑细胞系,命名为SFB.SFB最适培养液为含有15％胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12和L-15等比混合培养液,培养条件为27℃,5％ CO2.生长特性研究表明,第65代细胞的群体倍增时间为43.048h,显示出旺盛的生长和分裂能力.染色体分析发现,培养细胞的染色体众数为48条,SFB核型公式为2n =2st +46t,臂指数(NF) =48,与剑尾鱼一致.诱导实验表明,SFB在10-8～ 10-5 mol/L的苯并(a)芘诱导下,CYP1A mRNA表达量显著提升,且表现出良好的剂量效应关系.脑细胞系的建立为剑尾鱼的毒理学评价研究提供了便利,也为其系统的生态毒理学应用打下基础.     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。     

免疫学和分子生物学技术在水产动物疾病诊断中的应用

目前,各种免疫学和分子生物学技术的发展和在水产养殖病原微生物检测和诊断中的广泛应用,对水产养殖病害的有效防控起到了巨大的促进作用。论文回顾了主要免疫学技术(单克隆抗体、酶免疫、凝集反应、荧光抗体、胶体金)和分子生物学技术(核酸杂交、基于PCR的分子生物学检测技术、限制性内切酶分析、16 S rRNA、基因芯片)的特点以及其在水产动物疾病诊断中的研究及应用情况,并分析了今后水产动物疾病诊断技术的发展方向。     

草鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药物敏感性分析

从贵州兴义某水库网箱养殖的患病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中分离出菌落大小、形态一致的细菌,编号为GZ09007。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为气单胞菌(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA和gyrB基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。该菌株具有act、aer、lip、exu、fla、ser等毒力相关基因,不具有alt、ast、gca T和ahy B等毒力相关基因。人工感染试验表明该菌对草鱼、鲫、团头鲂和鳙均具有强致病性,半数致死量LD_(50)分别为7.45×10~5、1.27×10~5、1.76×10~5和5.36×10~4 CFU·(g·B·W)~(-1)。药物敏感性试验表明该菌对萘啶酸、恩诺沙星和左旋氧氟沙星等12种药物敏感,对新霉素、呋喃唑酮中度敏感,对氨苄西林耐受。研究结果表明维氏气单胞菌GZ09007是引起此次草鱼发病的致病菌。