应用奇异变形杆菌多克隆抗体提高沙门菌分离鉴定准确性的研究

在沙门菌检测过程中,奇异变形杆菌经常作为一种假阳性菌而出现。为提高沙门菌分离鉴定的准确性,我们制备了奇异变形杆菌的多克隆抗血清。抗血清经protein G抗体纯化柱纯化,与奇异变形杆菌混合后,在扫描电镜下观察二者的相互作用,分析该抗体是否能够在体外特异性的裂解奇异变形杆菌。经扫描电镜分析,制备的多克隆抗体在2h后将奇异变形杆菌裂解。同时,将纯化的抗体分别添加到氯化镁孔雀绿肉汤（MM）和亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）中分析对奇异变形杆菌的抑菌效果。在实际应用中,针对临床的100多份样本,进行改进方法与常规方法的比较,结果显示,改进的方法能够有效排除因奇异变形杆菌带来的假阳性干扰,明显提高了沙门菌分离鉴定的准确性。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法.根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测.以正常鸭胚尿囊液、正常鸭肝组织、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小...     

使用Eva Green染料的荧光PCR定性检测转基因产品

本文把一种新型荧光染料——Eva Green应用在荧光PCR中,通过设计特异性的引物来检测转基因产品。所检测的转基因基因包括内对照基因rbcl,外源基因的筛选基因Carny 35S启动子,NOS终止子,NPTⅡ基因,外源基因的鉴定转基因大豆roundupready的CP4CP4EPSPS和转基因马铃薯NEWLEAF的PVYcp。实验结果表明,各对引物特异性强,使用EvaGreen荧光检测的结果稳定,检测线可以小于0．5％．     

用AFLP方法分析中国对虾抗病选育群体的遗传变异

利用AFLP技术对连续4年选育的中国对虾抗白斑病毒群体进行了遗传分析,并比较了不同的数据处理方法对遗传学参数的影响。7个EcoRⅠ／MseⅠ引物组合共产生350个位点,其中202个为多态位点。4代群体的多态位点比例分别为：39．4286％,41．4286％,33．4286％,39．1429％,Nei基因多样性指数分别为：0．1197,0．1259,0．1133,0．1249;4代群体的Shannon多样性指数分别为0．1831,0．1917,0．1702,0．1896。遗传多样性水平除了第3代群体标本明显较低外,其它3代甚为接近,维持在一个恒定的水平。比较了Nei分析、Shannon信息指数分析、AMOVA分析得出的遗传学参数,建议AMOVA分析作为应用AFLP进行群体遗传学分析时首选的统计方法。在AFLP指纹图谱中发现共显性基因座,对其中1个基因座的两个AFLP片段进行了回收、克隆及测序。序列分析表明,多态性是由引物扩增区域内4个核苷酸的插入／缺失导致的,证明了AFLP标记并不完全是显性标记。实验表明AFLP技术灵敏度高,信息量大,适用于分析亲缘关系较近的个体或品系,在中国对虾分子标记辅助育种方面有应用潜力。     

一例进口皮张炭疽杆菌ASCOLI反应和PCR检测双假阳性的确认

炭疽杆菌是公认的严重的人兽共患病之一,是进出口检疫的法检项目。作为我国生牛皮进口国之一的美国,随着近几年美国发生的恐怖分子的炭疽邮件事件及美国炭疽病的发生,对炭疽病的风险分析研究已经在世界各国引起强烈关注。根据行业标准SN/T1700—2006即《动物皮毛炭     

应用多重PCR检测和区分3个型的马疱疹病毒

针对马疱疹病毒（EHV）的EHV-1、EHV-2和EHV-4糖蛋白B基因序列，设计、合成了3对特异性引物进行多重PCR，不仅可以在数小时内分别检测这3个型的EHV，而且在同一反应系统内可以清晰地区分EHV-1、EHV-2和EHV-4，其PCR产物大小分别为226、333、570bp，符合预期的片段大小，序列分析证实与已发表的序列一致；该检测方法的灵敏度达到10^3 TCID50；分别从血清学阳性但病毒分离为阴性的1匹进口马组织样品和一些出口前检疫马的鼻咽样品检测到EHV-1和EHV-4特异性核酸。     

虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

AFLP分子标记技术的发展及其在海洋生物中的应用

AFLP分子标记技术是一种建立在PCR技术和RFLP标记基础上的新的DNA指纹技术,具有多态性丰富、结果稳定可靠、重复性好、所需DNA量少,且可以在不需预先知道基因序列的情况下进行研究等特点,现已被广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、系统进化及分类学、遗传育种和种质鉴定以及基因定位等方面。本文简要介绍AFLP分子标记技术的原理、特点、发展及其在海洋生物中的应用现状及前景展望。     

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用Primer Explorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化.与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应.将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级.该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测.用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断.