肉质软珊瑚快速扩繁技术研究

[目的]为海洋资源开发和生态环境修复等提供有效途径。[方法]探索肉质软珊瑚的人工快速扩繁方法。[结果]肉质软珊瑚具有快速的修复能力,能很快在肉质层的伤口处形成愈伤组织。通过该方法成功实现了肉质软珊瑚的快速人工扩繁。[结论]肉质软珊瑚内可能含有许多活性物质,具备一定的药物开发潜力。     

方斑东风螺“脱壳病”病原及病理初步研究

为明晰方斑东风螺"脱壳病"的病原或病理,对东风螺"脱壳病"进行了病原分离纯化、病原菌形态观察、组织病理观察、人工感染试验,并对病原菌16S rDNA序列进行PCR扩增和测序,以及系统发育树分析。试验中分离纯化了3种纯菌W、B、Y。致病菌W杆状,端生单鞭毛。致病菌Y杆状,两端略尖,周生菌毛。致病菌B短杆状,无鞭毛。结果显示,患病个体和人工感染个体的腹足及连壳肌肉组织均出现明显病变,肌纤维受损,出现空腔,并存在细菌;肝胰腺组织无明显病变,但血细胞显著减少。腹足肌注射人工感染试验结果表明,致病菌W在3种细菌中毒力最强。混合菌感染的毒力在混合比例接近原始比例时达到最大。致病菌B与报道的鲍希瓦氏菌相似度为99%;致病菌Y与报道的哈维弧菌相似度为98%;致病菌W与报道的变形假单胞菌相似度为99%。推测致病菌W、B、Y可能是此次方斑东风螺脱壳病的重要病原菌。     

日本对虾养殖群体两个世代遗传结构的微卫星分析

利用8对微卫星引物对日本对虾养殖群体两个世代的遗传结构进行了分析,共检测到108个等位基因,等位基因长度为196-528 bp,各位点等位基因数为6-23个。亲本和子代群体每个位点平均等位基因数目分别为8.5个和11.5个,平均观测杂合度分别为0.721和0.632,平均期望杂合度分别为0.775和0.764,平均多态信息含量分别为0.732和0.729。根据标记信息,利用最大似然法对两个世代的个体分别进行系谱结构推断,亲本群体划分为6个群体,群体间遗传距离为0.277-2.356,均值为1.510;子代群体划分为17个群体,群体间遗传距离为0-2.593,均值为1.113。亲本和子代分群体间的遗传距离变化范围为0-3.089,均值为1.238。根据各分群体间的Nei's遗传距离,用非加权组平均法(UPGMA)构建了日本对虾两个世代的遗传进化树。其中18个分群体(4个亲本群体和14个子群体)经过聚类后形成3个分支,其余5个分群体(两个亲本群体和3个子群体)明显偏离于主支。研究发现,子代的观测杂合度明显低于亲本,说明子代在继承亲本遗传信息的过程中已经丢失了一定的杂合性。     

用微卫星标记分析不同形态变异类型日本囊对虾的遗传多样性

选用9个多态性微卫星分子标记,分析我国近海浙江舟山(ZS)、福建厦门(XM)、广东惠来(HLQ及HLB)、海南陵水(LS)及广西北海(BH)日本囊对虾6个群体2种形态变异类型群体间的遗传变异,探讨了日本囊对虾的种质资源状况。结果显示,9个位点在6个日本囊对虾群体中均为高度多态(PIC>0.5),共检测出235个等位基因;6个群体平均等位基因数在13.2～17.7;PIC平均值在0.851 2～0.903 5;平均观测杂合度(Ho)在0.729 6～0.788 9,平均期望杂合度(He)在0.880 5～0.925 1;表明群体遗传多样性水平较高。Hardy-Weinberg平衡检测显示,6个群体普遍存在杂合子缺失现象。分子变异方差分析(AMOVA)结果表明,遗传变异6.94%来自群体间,93.06%来自群体内。由ZS、XM和HLQ群体组成的形态变异类型Ⅰ与由HLB、LS和BH群体组成的形态变异类型Ⅱ之间的Fst均大于0.05,发生了中等程度的遗传分化;相同形态变异类型各群体间的Fst均小于0.05,遗传分化不明显。日本囊对虾群体间的遗传距离(DA)为0.178 5～0.621 8;UPGMA聚类分析表明,聚类关系符合距离隔离模式,BH群体和LS群体遗传距离最小,亲缘关系最近,它们首先聚在一起,然后与HLB群体聚为一支;XM群体和HLQ群体先聚在一起,再与ZS群体聚为另一支。     

拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因的克隆与表达分析

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。     

杂合抗菌肽Scy-Hep3在毕赤酵母中的分泌表达及其抗菌活性

为获得体外稳定表达的高抗菌活性新型抗菌肽,通过重叠延伸PCR技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Scygonadin (简记为Scy)和斜带石斑鱼抗菌肽Hepcidin 3 (简记为Hep3)的杂合抗菌肽基因scygonadinhepcidin3 (简记为scy-hep3),将scy-hep3与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-scy-hep3,用电转化法将其转化至毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽Scy-Hep3,并进行抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-scy-hep3,用体积分数为0. 5%的甲醇诱导表达24 h,分泌表达上清液中获得了稳定表达的相对分子质量约24 000的表达产物,与预期杂合抗菌肽Scy-Hep3的大小相符;抗菌活性结果表明,杂合抗菌肽Scy-Hep3具有广谱抗菌活性,对被测的3种革兰氏阳性菌(溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus、谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和4种革兰氏阴性菌(施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和弗氏志贺氏菌Shigella flexneri)具有较强的抗菌活性(最小抑菌浓度MIC12μmol/L);对比于单一的抗菌肽Scy和Hep3,杂合抗菌肽Scy-Hep3的抗菌活性显著增强。本研究结果将为杂合抗菌肽Scy-Hep3的生产和开发应用提供数据资料。     

温度和盐度对华贵栉孔扇贝幼虫存活联合效应研究

利用中心复合实验设计法研究了温度和盐度两个环境因子对华贵栉孔扇贝幼虫存活的影响。采用响应曲面分析法确立了存活的二次回归方程,同时进行优化处理得到温度、盐度的最佳组合。结果显示在华贵栉孔扇贝幼虫存活中温度与盐度在一定的范围内的互作效应不显著,其中温度效应较为明显。温度对存活率影响的一次项效应和二次项效应均达到显著水平(P0.0001)。盐度对存活率影响的一次项效应不显著(P0.05),然而,盐度对存活率影响的二次项效应达到显著水平(P0.0001)。响应曲面法对华贵栉孔扇贝幼虫存活率不同日龄同时进行优化,其结果显示最佳温度、盐度组合为24.68℃和28.03,此条件下20日龄存活率为48.25%,其满意度函数值达到93.04%。     

官井洋大黄鱼资源的兴衰演变及其修复对策

大黄鱼(Larimichthys crocea)被誉为"国鱼",曾经是中国四大海洋渔业种类之首。20世纪50~60年代大黄鱼资源丰富,东海区年产量达10×104t以上。内湾性官井洋是大黄鱼的主要产卵场之一,其生殖群体有春夏季产卵的春宗和秋季产卵的秋宗生态群体之分。1956~1961年闽东和浙江渔场发展敲罟作业,敲罟禁捕后又大力推广机帆船大围缯和对拖网渔船作业,严重的过度捕捞破坏了官井洋大黄鱼产卵群体资源,致使产卵群体小型化、低龄化和性早熟。当前资源已经衰退枯竭,趋于濒危物种。本文叙述了官井洋大黄鱼地理种群归属、生活史类型、产卵群体的分布洄游以及资源的兴衰演变过程,并提出一些修复官井洋大黄鱼资源的对策,以供海洋渔业界讨论。     

大黄鱼刺激隐核虫病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测分析

由刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染引发的"白点病"为大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖业带来重大损失,但仍未找到安全、有效的治疗方法。本研究应用免疫组织化学方法,对健康大黄鱼和患刺激隐核虫病大黄鱼肠、脾、头肾与肝组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)蛋白进行检测,研究刺激隐核虫病大黄鱼组织中MIF的表达情况及其对预后的影响。结果表明,MIF在健康大黄鱼肠、脾、头肾、肝各组织中均无表达;MIF在刺激隐核虫病大黄鱼各组织中高表达,表达强度从弱到强依次是肠、肝、脾、头肾,MIF表达阳性率分别为54%、80%、86%、90%。推测MIF在大黄鱼刺激隐核虫病发病过程中发挥作用。     

皱纹盘鲍HdhTPX2基因在毕赤酵母中的表达及抗氧化活性研究

为研究皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX2)蛋白的抗氧化活性,将HdhTPX2基因克隆至pPIC9K载体,通过电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,获得重组表达质粒pPIC9K-HdhTPX2,经甲醇诱导及亲和层析纯化得到重组HdhTPX2蛋白,并进行质谱鉴定及体外抗氧化功能检测。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-HdhTPX2,经表达条件的优化,在pH为7的培养基中用0.5%甲醇诱导表达72 h,分泌表达上清液中得到相对分子质量约为25 000的稳定表达产物,纯化后的蛋白经质谱鉴定为目的蛋白;体外活性测定发现,该蛋白清除羟自由基(·OH)能力强于维生素C,并对H_2O_2引起的细胞损伤具有一定的保护作用。研究表明,皱纹盘鲍硫氧还蛋白过氧化物酶HdhTPX2在毕赤酵母表达系统中得到高效表达,重组表达产物具有抗氧化活性功能。