吉富罗非鱼对饲料精氨酸的需要量

以饲料精氨酸水平分别为0.67%、0.94%、1.24%、1.58%、1.86%和2.11%的6种等氮等能的半纯化饲料(粗蛋白质含量30.21%,总能17.77 MJ/kg),投喂初始体重为(81.52±2.00)g的吉富罗非鱼60 d,考察饲料精氨酸水平对吉富罗非鱼生长性能、饲料利用、体成分、血清生化指标和非特异性免疫指标的影响,以期获得吉富罗非鱼对饲料精氨酸的最佳需要量。每种饲料投喂3个网箱,每个网箱放养15尾鱼。结果表明:随着饲料精氨酸水平的升高,吉富罗非鱼的增重率、特定生长率、蛋白质效率以及蛋白质沉积率均呈现先上升后下降的趋势,并均在1.58%组达到最高值,与其他组差异显著(P0.05);饲料系数、肝体比、脏体比则呈现先下降后上升的趋势,饲料系数在1.58%组达到最低值,与其他组差异显著(P0.05);全鱼粗脂肪和肌肉粗灰分含量的变化趋势与饲料系数相似,肌肉粗脂肪呈现与增重率和特定生长率相似的变化趋势,而全鱼粗灰分和肌肉粗蛋白质含量则呈先上升后稳定的趋势。饲料精氨酸水平对吉富罗非鱼的肥满度,全鱼水分、粗蛋白质及肌肉水分含量无显著影响(P0.05)。肌肉中各氨基酸(除酪氨酸、甘氨酸、丙氨酸外)、必需氨基酸、总氨基酸含量均随饲料精氨酸水平的升高呈先上升后下降的趋势。饲料精氨酸水平显著影响血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性及总胆固醇、甘油三酯、总蛋白、尿素氮和葡萄糖含量(P0.05),也显著影响肝脏和血清中总超氧化物歧化酶、总一氧化氮合酶和溶菌酶的活性(P0.05)。以增重率、饲料系数和蛋白质效率为主要评价指标,通过二次回归分析可知,吉富罗非鱼对饲料中精氨酸需要量为1.51%~1.58%,占饲料蛋白质的4.99%~5.25%。     

长江下游狼山沙和新开沙水域渔业资源群落结构特征分析

为了解中华绒螯蟹Eriocheir sinensis幼蟹主要栖息地渔业资源群落结构特征,于2016年6月—2017年1月在长江下游的狼山沙和新开沙水域放置定制网具,对两沙洲渔获物的种类组成、生态类型、优势种、多样性指数和群落结构特征等进行了分析。结果表明:两沙洲捕获物种共37种,隶属于8目16科,各物种以底层杂食性鱼类为主;优势种为中华绒螯蟹、日本沼虾Macrobrachium nipponense和无齿螳臂相手蟹Chiromantes dehaani等;有水生植物站点的Shannon-Wiener指数、Margalef指数、Wilhm改进指数和Pielou指数均低于无水生植物站点,有水生植物站点的Mc Naughton指数高于无水生植物站点;根据聚类和非参数多维尺度分析(NMDS)可将渔业资源群落分为3类,Ⅰ类渔业生物种类少、物种丰富度指数低,Ⅱ类中华绒螯蟹和无齿螳臂相手蟹的捕捞数量及质量占绝对优势,Ⅲ类渔业生物种类多、物种丰富度指数高。研究表明,狼山沙和新开沙渔业生物种类较少,渔业资源群落结构不稳定,有必要加强对两沙洲及邻近水域渔业资源群落结构的修复。     

鲤疱疹病毒3型T分离株主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3,CyHV-3)主要免疫原性蛋白,研究采用CyHV-3-T分离株感染CCB细胞系,运用蔗糖密度梯度超速离心方法对CyHV-3进行纯化,纯化的病毒颗粒经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色后,用锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)抗CyHV-3阳性血清进行Western blotting分析和液相色谱串联质谱鉴定。结果表明,透射电镜下可观察到大量完整囊膜包裹或只有裸露核衣壳的CyHV-3颗粒,Western blotting结果显示抗CyHV-3阳性血清与多种病毒蛋白具有明显特异性免疫反应,质谱鉴定表明其中4种免疫原性蛋白分别为ORF92、ORF66、ORF72和ORF81,其中ORF66和ORF72为首次鉴定的具有免疫原性衣壳蛋白。本研究将为CyHV-3血清学诊断方法的建立、亚单位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候选抗原。     

海蜇Frizzled1基因的克隆及在无性繁殖中的表达

采用RACE技术解析了海蜇(Rhopilema esculentum)Frizzled1基因的cDNA和基因组结构:Re-Fzd1基因的全长cDNA为2387 bp,其中编码区为1761bp,编码586个氨基酸的多肽。SMART分析表明,Re-Fzd1基因具备Fzd家族共同的结构特征,包括:一个由23个氨基酸组成的信号肽,一个位于N-末端富含10个保守半胱氨酸残基的半胱氨酸富集域(CRD),一个含有7个跨膜片段的跨膜结构域,以及一个含有5个重要的磷酸化位点的C端尾巴。多序列比对表明,Re-Fzd1基因与刺胞动物贝螅(Hydra echinata)、水螅(Hydra vulgaris)、半球美螅水母(Clytia hemisphaerica)和海葵(Nematostella vectensis)Fzd1具有高度相似性,与来自脊椎动物人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)的Fzd1、Fzd2和Fzd7家族基因也具有较高的同源性。基于N-J法,将人、鼠、爪蟾、斑马鱼和果蝇(Drosophila melanogaster)所有Fzd家族基因系统进化分析显示,除果蝇外,所有Fzd家族成员聚类成4个类群,11个亚家族,海蜇Re-Fzd1基因首先与刺胞动物门的Fzd1聚类在一起,然后与脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7三个家族聚成一个类群,表明脊椎动物Fzd1、Fzd2和Fzd7家族可能与刺胞动物门的Fzd1起源于同一个共同祖先。Re-Fzd1基因组序列中不含有内含子。实时荧光定量PCR结果显示,Re-Fzd1基因在海蜇无性繁殖的4个发育阶段均有表达,其中,表达量最高的横裂体阶段是表达量最低的稚水母阶段的3.67倍。整体原位杂交显示,在海蜇横裂体时期,Re-Fzd1原位表达在触手、基座及发生横裂的部位。这些结果都表明,Re-Fzd1不但参与了海蜇的早期发育过程,还调控了海蜇无性繁殖的发生。     

养殖鱼源嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制

为研究体外诱导敏感嗜水气单胞菌耐药后,其敏感性变化与基因突变、外排作用的关系,实验选取对氟喹诺酮类药物敏感的养殖鱼源嗜水气单胞菌临床分离菌株为研究对象,分别在含亚抑菌浓度恩诺沙星(EN)和诺氟沙星(NF)的培养基上逐步诱导培养,以获得高耐药菌株;对诱导菌株gry A和par C基因进行扩增和测序分析;测定诱导菌对诱导药物和16种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)后的MIC值变化;并对诱导菌交叉耐药情况进行比较分析。结果发现,诱导后菌株对EN和NF的MIC分别提高了409.6和4096倍,对非诱导氟喹诺酮类药物和其他类药物的MIC也有较大变化;药物诱导后各菌株gyr A基因和par C基因编码的氨基酸QRDRs区发生了典型的点突变:Gyr A发生Ser83→Ile变化,Par C发生Ser87→Ile/Arg变化;添加NMP后,所有诱导菌株对两种药物的MIC值均有不同程度的下降;诱导后菌株交叉耐药情况与菌株密切相关,其中3和8号诱导菌株对16种非诱导药物均无交叉耐药反应,而EN诱导菌株对氨基糖苷类和利福霉素类药物基本未产生交叉耐药反应,NF诱导菌株对除庆大霉素以外的氨基糖苷类和利福霉素类药物基本未产生交叉耐药反应,所有诱导后菌株均对四环素类和氯霉素类药物产生较严重的交叉耐药。研究表明,嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类耐药存在靶基因位点突变及主动外排作用等多种耐药机制;且应慎重考虑在防治耐药菌株引发病害时,交叉耐药情况对选择治疗药物的影响。     

基于牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因的巢式PCR检测方法的建立及应用

为了建立适用于Os HV-1不同变异株的检测方法,在牡蛎疱疹病毒(Os HV-1)3个变异株全基因组序列比对的基础上,筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的DNA聚合酶(DNA polymerase)基因,据此设计巢式PCR引物,优化PCR反应体系和条件,建立了基于Os HV-1 DNA聚合酶基因的巢氏PCR检测方法(P-n PCR检测方法),利用P-n PCR与Cn PCR检测方法对不同年份和宿主来源的Os HV-1疑似感染样本进行检测。结果显示,Pn PCR检测方法能稳定地检出100拷贝/μL的病毒DNA;P-n PCR较C-n PCR检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR检测方法适用于Os HV-1不同变异株的检测,可为该病毒的检测和流行病学调查提供可靠的技术支持。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。     

猪-鱼复合养殖模式中气单胞菌I类整合子的流行情况及其耐药特征

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶基因intI1,并分析其基因盒阵列结构。结果表明,317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高。intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个Ⅰ类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因bla_(OXA-10)、bla_(OXA-21),氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac(6')-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。研究表明,I类整合子分布于广东地区猪-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。     

印度产紫菜Pyropia chauhanii优良品系的选育与特性分析

为培育出藻体薄且适合在我国南方高水温海区栽培的紫菜新品种,利用~(60)Co-γ射线辐照和高温胁迫处理印度产紫菜Pyropia chauhanii野生型品系(PC-WT)的叶状体,分离出优良品系PC-M,随后通过研究2个品系在耐高温性、生长、主要光合色素含量、单孢子和壳孢子放散量等方面的差异后发现,在18和23°C温度组中,2个品系的壳孢子存活率、分裂率和假根发生率均无显著性差异,但在27和29°C温度组中,PC-M品系的壳孢子存活率比PC-WT品系分别提高了250.7%和305.4%,分裂率分别提高了42.4%和67.1%,假根发生率分别提高了86.6%和175.3%;将在23°C下培养30 d的叶状体分别置于18、23、27和29°C下培养10 d,在18、23和27°C组中,PC-M品系的叶状体绝对生长率分别是PC-WT品系的5.1、5.3和7.5倍,特定生长率分别是PC-WT品系的1.3、1.3和1.8倍;在27°C下培养15 d或在29°C下培养10 d,PC-WT品系的叶状体均放散了大量的单孢子,藻体流失严重,仅剩下基部,而PC-M品系的叶状体均没有放散单孢子、藻体形态完整、光泽好、生长速率快,培养至30 d后才发生轻微的卷曲。与PC-WT品系相比,常温组(23°C)的PC-M品系的3种主要光合色素(chl.a、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量以及壳孢子放散量分别提高了39.4%、209.8%、94.8%和36.7%,但藻体的平均厚度反而减少了31.6%。上述结果证实,与PC-WT品系相比,PC-M品系具有藻体薄、色素含量高、生长快、耐高温、壳孢子放散量大、单孢子不放散等优点,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的克隆、组织表达分析和原核表达

为探究双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的作用和表达模式,本研究通过RACE技术克隆了双须骨舌鱼amh基因全长c DNA序列,发现存在amh1、amh2两个亚型(Gen Bank登录号KU378662、KU378663)。序列分析结果显示,双须骨舌鱼amh1基因的c DNA全长2277 bp,编码623个氨基酸,amh2基因c DNA全长2181 bp,编码355个氨基酸。同源性分析显示,amh基因保守性较低,双须骨舌鱼与同科的美丽硬仆骨舌鱼相似度最高,为85.64%,与不同科鱼类的相似度均低于42%。系统进化分析显示,该基因与骨舌鱼目聚为一支,与鲱形目、鲤形目等较低等的硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。用荧光定量PCR检测的结果显示,amh基因在双须骨舌鱼不同组织中均有表达,其中amh1亚型在精巢中表达量最高,且明显高于卵巢和其他组织;amh2亚型也在精巢中表达量最高,且明显高于其他组织,但远远低于amh1在精巢中的表达。构建了原核表达载体p ColdⅠ-amh1和p ColdⅠ-amh2并在大肠杆菌中成功诱导出大小分别为68和48 ku的融合蛋白,为进一步研究amh在双须骨舌鱼体内的生物功能奠定了基础。