Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Th1/Th2型细胞因子表达分析

检测Ⅱ型糖尿病猕猴部分靶器官中Ⅰ型辅助T细胞(Th1)因子IL-2和IFN-γ以及Ⅱ型辅助T细胞(Th2)因子IL-4、IL-10的表达及分布变化情况,研究Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病发病中的变化。取Ⅱ型糖尿病及健康猕猴胰腺、肝、肾和心脏,通过石蜡切片、常规染色观察病理变化,同时采用免疫组织化学SABC法检测各靶器官IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达及分布情况。病理结果显示:糖尿病猕猴肝血窦增宽伴中性粒细胞浸润,肾、心脏和胰腺细胞呈不同程度肿胀、萎缩及坏死。免疫组织化学结果显示:在肾中Th1型细胞因子IFN-γ表达水平高于健康组(P0.01)并分布于近曲小管、远曲小管及集合管。胰腺中IFN-γ表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P0.05),阳性产物分布于胰岛部及外分泌部。胰腺及肾中Th1型细胞因子IL-2表达水平与健康组相比差异无统计学意义(P0.05)。胰腺及肾中Th2型细胞因子IL-4表达水平显著低于健康组(P0.01),阳性产物分布于远曲小管、胰腺胰岛及外分泌部。在胰腺、肾、肝及心脏中,Th2型细胞因子IL-10表达水平显著高于健康组(P0.01),阳性产物分布于近曲小管、远曲小管、胰腺胰岛、胰腺外分泌部、心肌细胞及肝细胞的胞质中。Th1/Th2型细胞因子在Ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)的发病过程中发生了显著变化。     

鸭传染性浆膜炎油佐剂灭活疫苗的研究

以血清Ⅰ型鸭疫里默氏菌(RA)分离株为菌种研制RA油佐剂灭活疫苗,对3日龄樱桃谷鸭颈背皮下注射0.25mL/只即可产生良好的免疫应答,免疫后10、13和16天对同源RA的攻击表现出35%、85%和100%免疫保护。疫苗一次免疫后30天ELISA抗体滴度达到高峰,至93日龄时仍能检出抗体。10日龄进行第二次免疫可产生更高的抗体滴度,到65天时仍能保持较高抗体水平。ELISA抗体滴度≥500时雏鸭即获得免疫保护。疫苗免疫雏鸭后能够显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地增强T细胞的免疫力,时间持续两周。RA油佐剂灭活疫苗免疫雏鸭后免疫保护的形成是体液免疫与细胞免疫协同作用的结果,其中体液免疫占主导作用。     

鸭瘟病毒VP 26基因克隆和分子特性分析

利用作者实验室已构建的DPV CHv株基因文库重组质粒的DNA测序信息,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具分析得到了编码该病毒VP26蛋白基因(UL35)的ORF,然后采用PCR扩增出了VP26基因并将其克隆到pMDl8-T载体上,经PCR和酶切鉴定以及进一步的核酸斑点杂交试验证实该基因即为DPV的VP26基因.分子特性分析表明:该基因大小为354 bp,编码117 aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPV VP26蛋白与GenBank上多种a疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性.系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科,而且有可能属于新的属.另外,亚细胞定位分析表明,VP26主要定位于细胞核中.密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,DPV VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个.上述研究结果为进一步研究DPV VP26蛋白的功能和作用机理提供分子生物学依据.     

生物素标记寡核苷酸探针原位检测石蜡切片鸭瘟病毒核酸

据GenBank中有关鸭瘟病毒(DPV)的1个765 bp的EcoRⅠ片段序列,用Oligo软件设计长度为37 bp的寡核苷酸并用生物素标记制备探针,经blast分析和斑点杂交检测探针的特异性后,建立从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法并对人工感染死亡鸭的各组织器官进行检测,结果显示:(1)寡核苷酸探针能特异性检测到DPV强毒CHv株DNA,对鸭病毒性肝炎病毒QL79株RNA、血清1型鸭疲里默氏杆菌DNA、鸭源多杀性巴氏杆菌DNA、鸭沙门菌DNA和大肠杆菌DNA的检测结果为阴性.(2)以寡核苷酸探针建立的从石蜡切片中检测出DPV核酸的原位杂交方法的最佳反应条件为:组织切片先用0.2 mol/L HCl 37℃处理20 min,然后用100 mg/L的蛋白酶K 37℃消化15 min左右;杂交时探针工作浓度为350 μg/L;Avidin-AP的工作稀释度为1:100.(3)以所建立的原位杂交法检测DPV-CHv强毒人工感染死亡鸭的各组织器官,结果肝脏、肠道、法氏囊、脾脏、食道、肺脏和肾脏呈阳性反应,DPV的DNA分布于特定细胞的细胞浆和细胞核.结果表明,原位杂交检测石蜡切片中DPV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DPV进行检测和病原定位的良好方法,可用于DPV的侵染过程和致病机理研究及回顾性诊断检测.     

鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达.     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）的基因序列,在ＰＲＶｇＥ基因阅读框外的上、下分别设计一对引物Ｐ１和Ｐ２,在引物的 ５’端分别加上 ＫｐｎＩ和 ＥｃｏＲＩ位点。以 ＰＲＶ Ｆａ株的 ＤＮＡ为模板成功地扩增得到一条长的 １．７ｋｂ的片段,经酶切鉴定,初步确定为ｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物经ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ消化后与同样酶切的ＰＵＣ１８质粒连接、转化,得到了明显大于载体的重组质粒ＰＰｇＥ。重组质粒ＰＰｇＥ经酶切鉴定确定为含有ＰＲＶ 的 ｇＥ基因,测序ＰｐｇＥ得到完整的ｇＥ基因片段,并与４株不同来源的毒株进行了比较分析。在对 ＰＲＶ Ｆａ（来自福建）、Ｒｉｃｅ（来自俄国）、ＴＮＬ（来自台湾）、Ｅａ（来自武汉）、ＳＨ（来自上海）的ｇＥ同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达９７％,这一定程度上也体现ｇＥ基因组的保守性。分析还表明Ｆａ与ＴＮＬ同源。同时９９％的高同源性也显示 Ｆａ、Ｅａ、ＳＨ可能是同一毒株。本实验认为 ｇＥ序列在 １０４０－ １４１０碱基的高同源性区域作为ＰＣＲ检测或核酸探针是非常有用的。     

四川省鸭瘟病原的分离鉴定

用9～10日龄鸭胚和血清交叉中和试验从四川省七个疑似鸭瘟发病片区分离鉴定了七株鸭瘟病毒。经测定,这七个毒株与鸭瘟标准强毒AV1221F16代的血清型、抗原性一致,没有血凝特性,对氯仿敏感,属于DNA病毒;鸭胚半数致死量DELD50为10^-4.59～10^-5.92/0.2mL;本动物回归使四川麻鸭在3～7天死亡;电镜下观察成熟病毒粒子呈球形成近似球形,带有囊膜,直径150～160nm,具有疱疹病毒的典型形态结构。     

雏鹅新型病毒性肠炎病毒的分离、鉴定及病原特性的研究

利用原代鸭胚成纤维细胞培养及蚀斑克隆技术从具有典型渗出性、坏死性病变的雏鹅新型病毒性肠炎（NGVE）病例的实质器官和肠道内容物中分离到26株病毒。经鉴定,26株病毒的中和性抗原是一致的。病毒（NGVEV）呈球形或椭圆形,无囊膜,直径70－90nm。不凝集鸡、鸭、鹅、鸽、黄牛、水牛及猪的红细胞。对氯仿处理1－3次不敏感。病毒于－15℃和0 ℃至少可以分别保存36和20个月;于37℃45d45℃48h、56℃5h、60℃1h不影响地细胞的致病变能力和对雏鹅的致病性;于80℃5min和煮沸（96℃）10s可以使病毒失活。病毒经药物抑制法和酶消化法均鉴定其核酸类型为DNA。在CsCl中浮密度为1．32g/cm^3.pH1．0和PH10．0处理1h可使病毒失活pH2．0和9．0可使病毒滴度有所下降,PH3．00－8．0对病毒的感染性没有影响。NGVEV与鸭瘟病毒和小鹅瘟病毒没有中和抗原相关性。分离和病毒通过滴鼻、点眼、皮下注射、肌肉注射、口服等途径人工感染均可复制出与临床表现一致的病例,其中口服最佳感染途径。根据分离到的病毒特性,这种病毒为一种雏鹅新的腺病毒。