宁夏枸杞果实细胞壁蛋白适宜提取方法研究

【目的】探索适合宁夏枸杞果实细胞壁蛋白提取方法,为后续进行宁夏枸杞蛋白质组学研究提供技术支持。【方法】以宁夏枸杞果实为试验材料,采用六步洗脱法去除胞浆蛋白,然后通过定量和电泳比较氯化钙提取法、氯化锂提取法、氯化钙加氯化锂结合提取法和苯酚提取法对细胞壁蛋白的提取效果,通过双向电泳与液相色谱对所得细胞壁蛋白进行验证。【结果】六步洗脱法可较好地除去胞浆蛋白与其他干扰物质,4种方法对宁夏枸杞果实细胞壁蛋白的提取效果排序为:氯化钙提取法（272μg/g）>苯酚提取法（261μg/g）>氯化钙加氯化锂结合提取法（217μg/g）>氯化锂提取法（176μg/g）。裂解液I[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、30 g/L 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、50 g/L二硫苏糖醇（DTT）]溶解蛋白质效果更优,蛋白质定量浓度更高、电泳条带更多、更清晰。氯化钙提取所得蛋白质样品双向电泳结果较好,蛋白质点数较多、清晰度和分辨率较高;通过液相色谱可看出氯化钙提取的细胞壁蛋白肽段种类多,且大部分相对丰度较高,并含有低丰度蛋白质。所测蛋白质分类中有细胞壁定位的蛋白质。【结论】氯化钙单独提取蛋白质样品的方法是宁夏枸杞果实细胞壁蛋白提取最优方法,所得蛋白质样品已达到进行蛋白质组学研究的标准。     

不同品种葫芦巴不同生长期POD同工酶酶谱分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，对葫芦巴进行了过氧化物酶（peroxidase简称POD酶）同工酶酶谱分析。结果表明：不同品种葫芦巴POD同工酶存在差异较小，但随着生长的进程，各器官的POD酶同工酶变化显著，以根的酶带数目及酶活性较稳定，而茎叶变化较大。     

大豆种子萌发中蛋白质组成的双向电泳分析

采用双向电泳技术分析了大豆种子萌发时期蛋白质的差异表达.研究发现,在考染胶上,通过PDQuest分析,在成熟干种子和萌发种子的2-DE图谱上分别获得341和376个蛋白斑点,两个时期的2-DE图谱非常相近,说明绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未开始降解.有21个蛋白点在萌发的大豆种子中表达量上调,9个表达量下调.对这些蛋白的进一步鉴定将有助于深入理解大豆种子萌发过程的生理及分子机制.     

碱性盐胁迫对宁夏枸杞生长、结构及光合参数的影响

采用盆栽试验,对碱性盐(NaHCO_3)胁迫下枸杞生长、叶片解剖结构、超微结构以及光合参数进行了研究。结果显示:随着NaHCO_3胁迫浓度的增加,净生长量呈先增加后降低的趋势,地上部干重、地下部干重和整株干重总体呈下降趋势,根冠比呈上升趋势;叶肉栅栏组织在低浓度NaHCO_3处理(150 mmol·L-1)时排列比较紧密,随着胁迫浓度增加,栅栏组织的细胞层数逐级减少,细胞结构紧密度逐渐降低,叶片厚度、上下表皮厚度及晶体数呈现先增后降的趋势;超微结构显示,随着胁迫浓度的升高,叶肉细胞形状变的不规则,叶绿体结构变形,基粒片层排列紊乱,淀粉粒增多;净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔限制值(Ls)和气孔导度(Gs)随NaHCO_3浓度的升高呈下降趋势,胞间CO_2浓度(Ci)呈升高趋势,水分利用效率(WUE)呈先升后降的趋势;相关分析显示,盐胁迫强度与净生长量、生物量、净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和气孔限制值呈负相关关系,与净光合速率、蒸腾速率和气孔导度呈显著负相关关系(P0.05)。由此说明,碱性盐胁迫改变了叶片的功能性状,促使枸杞光合作用下降,直接影响干物质积累及株高的生长。     

枸杞LbMYB1基因的克隆与表达分析

在前期的枸杞花药蛋白质组学研究鉴定差异表达蛋白的基础上,采用RT-PCR技术,从宁夏枸杞"宁杞1号"花药中克隆了一个花药发育差异表达MYB类蛋白基因。生物信息学分析表明,该基因编码R2R3类MYB转录因子的典型结构域,与其他物种MYB蛋白的氨基酸的相似性达72%以上,属于R2R3类MYB蛋白基因家族。将该基因命名为Lb MYB1,Lb MYB1包含一个975 bp的开放阅读框,编码324个氨基酸残基,分子量79.2 kv,等电点为4.95。实时定量RT-PCR检测表明,Lb MYB1基因在花药四分体形成时期高丰度表达,在花中的表达量也较高,果实中表达量较低,在根、茎及叶中未检测到表达,推测Lb MYB1基因可能与花药发育中有关。本研究为后继进一步探讨Lb MYB1蛋白在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能及其分子机理提供参考。     

枸杞转录因子LbMYB103在转基因烟草中的表达

为了探讨枸杞转录因子Lb MYB103在植物生长发育中的功能,本实验采用RT-PCR技术从宁夏枸杞‘宁杞1号’花药中分离了该基因的完整开放阅读框,并构建植物过表达载体p Cambia2301-ky-Lb MYB103,经农杆菌介导法转化烟草。通过抗性筛选和PCR鉴定得到T0代转基因阳性植株,对T0代阳性烟草种子进行抗性筛选、PCR鉴定获得遗传稳定的T1、T2代阳性转基因烟草,观察其生长发育状况及性状。结果表明,外源基因Lb MYB103已经成功整合进烟草基因组中并能够在Ca MV35s强启动子稳定表达。与野生型相比,转基因烟草长势较慢,株高为野生型一半左右,其花器官发育异常,部分花瓣畸变。推测枸杞Lb MYB103转录因子在烟草花器官发育过程中起调控作用,此结果为进一步探讨该转录因子在枸杞花器官发育过程中的调控作用提供了理论依据。     

大众创业背景下农民工返乡创业问题探究

在我国大力推动"双创"的背景下,农民工返乡创业已经成为一种"潮流",而且也受到了越来越多地方政府的高度重视,积极推动农民工返乡创业,但在实施的过程中也存在一些不容忽视的问题,需要引起重视。本文站在大众创业的历史背景下,对农民工返乡创业问题进行了深入地研究和分析,首先对农民工返乡创业存在的问题进行了梳理,在此基础上就如何促进农民工返乡创业工作的深入开展提出了对策。     

硒砂瓜连作对土壤真菌群落结构的影响

硒砂瓜是宁夏地区重要的经济作物,其连作严重影响硒砂瓜产量和品质。目前硒砂瓜连作对土壤真菌群落结构的影响尚不清楚。本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术,探讨硒砂瓜连作对土壤真菌群落结构的影响。研究发现,硒砂瓜连作土壤中真菌群落多样性指数和丰富度指数随连作年限的增加先上升后下降。供试土壤样本中共检测到真菌8门、25纲、244属,其中子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）是优势菌门,占90%以上。与对照相比,连作30年土壤中子囊菌门丰度下降32.51%,接合菌门丰度上升29.89%。供试土壤中真菌主要的优势属为被孢霉属（Mortierella）、绿僵菌属（Metarhiziun）、假霉样真菌属（Pseudallescheria）、镰刀菌属（Fusarium）和青霉属（Penicillium）。与对照相比,连作5年土壤中假霉样真菌属丰度增加45.81%,连作10年土壤中镰刀菌属丰度增加26.74%,连作15年土壤中绿僵菌属下降26.83%,连作20年土壤中青霉属增加29.68%,连作25年土壤中绿僵菌属减少18.30%,连作30年土壤中被孢霉属丰度上升29.89%。土壤理化性质与硒砂瓜连作年限间无显著相关性,而与土壤真菌群落结构存在显著的相关性。土壤全磷、碱解氮、有效磷含量是影响土壤真菌群落最主要的因素。研究结果表明,导致硒砂瓜连作障碍的主要原因不是土壤理化性质变化,而是土壤真菌群落结构的改变。研究结果可为硒砂瓜土传病害的生物防治提供参考依据。     

枸杞Lb14-3-3基因家族cDNA克隆及生物信息学分析

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本研究在前期枸杞花药发育差异蛋白质组研究基础上,利用RT-PCR技术,从宁夏枸杞‘宁杞1号’花药中克隆了5条长度分别为768 bp、747 bp、777 bp、753 bp和777 bp的cDNA序列,分别命名为Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,对Lb14-3-3a、Lb14-3-3b、Lb14-3-3c、Lb14-3-3d和Lb14-3-3e,5个基因编码蛋白质的结构预测发现,其蛋白质的分子量大小在60.91~64.14 kD之间,编码蛋白质的长度在248~259个aa之间,理论等电点在4.95~4.99之间,均为酸性氨基酸,且都为不稳定的亲水性蛋白。α-螺旋(Alpha helix)是这5个蛋白质二级结构的主要成分,三级结构主要是由α-螺旋构成的对称结构,具有高度的相似性。该家族蛋白既没有信号肽也无明显的跨膜区,亚细胞定位显示Lb14-3-3a定位在线粒体上,Lb14-3-3b和Lb14-3-3e定位在叶绿体上,Lb14-3-3c和Lb14-3-3d定位在细胞质中,Lb14-3-3a蛋白发生磷酸化修饰的可能性最高,Lb14-3-3b磷酸化的可能性最低。多序列比对分析显示,该家族蛋白之间的相似性为77.51%,具有高度的保守性。进化分析显示Lb14-3-3a与其它Lb14-3-3蛋白家族的亲缘关系较远,Lb14-3-3c和Lb14-3-3e,Lb14-3-3d和Lb14-3-3b处于同一分支,亲缘关系较近,Lb14-3-3家族蛋白与马铃薯、番茄、烟草等亲缘关系较近。研究结果为阐明该蛋白家族基因在枸杞花药发育过程中潜在的调控机理提供科学依据。