基于KASP技术的小麦条锈菌SNP分子标记开发与评价

为开发用于小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici群体遗传研究的竞争性等位基因特异性PCR-单核苷酸多态性(kompetitive allele specific PCR-single nucleotide polymorphism,KASPSNP)标记,以中国小麦条锈菌流行小种CYR32的基因组为参考,与美国小麦条锈菌流行小种PST78和印度小麦条锈菌流行小种38S102的基因组进行比对,根据比对到的SNP位点设计KASP-SNP引物,用64个中国小麦条锈菌标样对其进行筛选,同时用13对多态性引物组成的简单重复序列(sim‐ple sequence repeat,SSR)分子标记分析这64个标样,并利用Powermarker 3.25和Structure 2.3软件通过多态性指数和群体遗传结构分析来评价KASP-SNP和SSR两种分子标记。结果显示,共比对到29 929个SNP位点,设计出462对KASP-SNP引物,经64个中国小麦条锈菌标样筛选到43对多态性较好的引物,所开发的这43对KASP-SNP引物多态性信息含量指数平均为0.346,基因多样性指数平均为0.420,而SSR引物的2种指数分别为0.237和0.265,前者较后者分别高出46.0%和58.5%。2种标记结果的群体遗传结构分析可得到类似结果,最佳聚类数K值都为4,云南菌系是遗传结构相对最简单的菌系,湖北菌系是遗传结构相对最复杂的菌系,但个别菌株的遗传划分存在较大差异。表明本研究开发的KASP-SNP分子标记多态性较SSR分子标记更加丰富,具有较好的应用前景。     

西藏小麦条锈菌群体结构与遗传多样性

为查明西藏小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici群体结构和遗传多样性,采用中国鉴别寄主和近等基因系鉴别寄主,以及竞争性等位基因特异性PCR-单核苷酸多态性（kompetitive al-lele specific PCR-single nucleotide polymorphism,KASP-SNP）分子标记对2017年采自西藏的150个小麦条锈菌菌系分别进行表型分析和基因型分析。表型分析结果显示,中国鉴别寄主将150个菌系区分为 12 个已知小种、6 个已知致病类型和 13 个未知致病类型,所有菌系均不能侵染中四和Triticum spelta album鉴别寄主。近等基因系鉴别寄主将150个菌系区分为88个毒性类型,这些毒性类型均不侵染携带抗性基因Yr5、Yr10或Yr15的品种。基因型分析结果显示,26对引物将150个菌系划分为73个基因型,表明西藏小麦条锈菌群体基因型丰富。基因流分析结果表明,波密县与洛扎县小麦条锈菌亚群体之间的基因流N_m最高,达5.86,米林县西部与波密县、洛扎县、巴宜县、米林县东部条锈菌亚群体之间的N_m较低,分别为0.25、0.34、0.42和0.67,表明西藏不同地区条锈菌群体之间基因交流强度差异较大。说明西藏作为我国小麦条锈病的独立流行区,条锈菌群体毒性结构复杂,遗传多样性高。     

西藏林芝与内地小麦条锈菌分子群体遗传结构及菌源关系

 2009-2010年春季,先后从甘肃、四川、陕西和西藏四省的29个县(市)采集到1 391份小麦条锈病标样,繁殖获得961个菌株,利用SSR分子标记进行群体遗传分析结果表明:甘肃天水、平凉和陇南,陕西宝鸡及汉中,四川阿坝和广元等地条锈菌的遗传多样性比较丰富,而四川宜宾及凉山、西藏林芝的遗传多样性水平相对较低。利用Arlequin软件中的AMOVA方法分析结果表明,小麦条锈菌的遗传变异主要存在于群体内部。内地各种群之间菌源交流频繁(Nm＞4),西藏与内地菌源交流很少(Nm＜1)。采用Structure及聚类分析表明,陕西宝鸡与甘肃平凉间,陕西汉中、甘肃陇南、甘肃天水及四川广元间,存在着频繁的菌源交流关系,四川宜宾和凉山与四川阿坝、陕西汉中和甘肃陇南间存在着菌源交流关系。而西藏与内地间几乎没有菌源交流。初步认为西藏林芝小麦条锈菌可能是一个相对独立的遗传群体。     

我国小麦条锈菌体细胞遗传重组的分子证据

 小麦条锈病是影响我国小麦生产的重要病害之一,条锈菌毒性变异是引致小麦品种抗病性丧失的主要原因。本文应用SSR分子标记技术,研究了陇南越夏区小麦条锈菌群体遗传结构,以期寻找条锈菌群体遗传重组的分子证据。研究结果表明,陇南地区小麦条锈菌群体遗传多样性比较丰富而遗传分化较小,遗传变异主要存在于群体内部,而在群体之间,遗传多样性有显著的差异。在11对SSR引物中,有4对能够检测到陇南地区小麦条锈菌群体存在遗传重组,而且重组体出现的频率不同,CPS15揭示的条锈菌重组体出现的频率为20.0%,CPS34揭示的条锈菌重组体出现的频率为18.5%,RJ20揭示的条锈菌重组体出现的频率为12.8%,RJ18揭示的条锈菌重组体出现的频率为15.0%,陇南地区小麦条锈菌群体重组体出现频率平均为16.6%。本文揭示的遗传重组现象表明陇南地区条锈菌体细胞结合十分普遍,由此推测我国小麦条锈菌在自然条件下通过遗传重组而导致毒性变异的可能性。     

小麦条锈菌对三唑酮敏感性生测体系优化及其抗药性分子标记开发

条锈病是小麦上重要的真菌病害，严重威胁小麦的生产安全，施用杀菌剂是防治小麦条锈病的重要措施。三唑酮是防治条锈病的主要药剂，但长期单一、大规模使用三唑酮势必导致病原菌抗药性出现，由于小麦条锈菌是严格的专性寄生菌，目前测定条锈菌对杀菌剂的敏感性实验主要在活体小麦上进行，实验结果易受外界环境影响。本研究通过培养皿内离体小麦叶段培养，采取定量接种和软件读数的方法，对2021年西北核心越夏区60个小麦条锈菌菌株进行三唑酮敏感性测定，生测结果表明供试菌株平均EC₅₀值为0.543μg·mL^-1,抗性菌株7株，敏感菌株53株，11.67%的供试菌株对三唑酮具有低至中等水平抗性，分子标记结果与生测结果高度吻合。本研究通过优化三唑酮对条锈病防治效果的室内生测体系，使得结果更加稳定、重复性好，同时基于敏感/抗药菌株靶标基因序列分析开发了高通量的抗药性竞争性等位基因特异性PCR-单核苷酸多态性分子标记(KASP-SNP),旨在为防治小麦条锈病筛选高效杀菌剂，同时开展田间小麦条锈菌抗药性监测，了解抗药性分布及抗性水平，为小麦条锈菌抗药性综合治理提供科学依据。