碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

美国悬铃木反季节种植提前断根技术

随着当今城市建设步伐的加快,树木的反季节种植在园林绿化中已广泛应用,本文针对美国悬铃木反季节栽植过程中如何提高成活率采取的断根技术措施进行了探讨。     

猪肉品质的灰色关联分析和模糊综合评判

本研究采用灰色关联分析法和模糊综合评判对 37头猪进行了肉品质的评估 ,由于灰色关联度与肉品质各项指标的相关中 ,该值与pH值、肉色和大理石纹评分的相关关系不显著 ,而模糊综合评判值与pH值、大理石纹评分、肉色、失水率和 2 4小时贮存损失呈显著相关 ,因而我们认为 ,模糊综合评判比灰色关联分析更能够作为一个相对客观的指标来反映肉品质的好坏。     

河北省生态环境支撑区生态系统服务价值评估

[目的]研究和评估不同生态区主要生态系统服务功能和价值的变化,为区域的生态保护、自然资源核算和生态补偿等决策提供理论依据和参考。[方法]基于1980,2000和2015年的土地利用数据,采用单位面积价值当量因子法构建土地利用二级分类当量表,计算3个时段河北省各生态环境支撑区的生态系统服务价值。[结果]①1980—2015年河北省土地利用的变化主要表现为农田转为城乡建设用地,其他生态用地转为农田的趋势。②以2015年的价格计算,1980—2015年河北省总生态系统服务价值的年平均值约为3.56×10~(11)元。③1980—2015年河北省生态系统服务价值减少约7.00×10~9元。④单位面积生态系统服务价值最高的生态区为燕山—太行山,其次是坝上高原、海域海岸、京津保,最低的为低平原区。⑤1980—2015年京津保生态区生态系统服务价值下降幅度最大为28.1亿元,降低15.0%。[结论] 2000年后的生态环境建设对恢复和提升河北省生态系统服务功能发挥了重要作用。     

红薯田间管理技术

红薯是河南主要农作物之一,是高产稳产的作物。根据红薯生长期间土壤特性和生长特性,从育苗、整地、肥水管理等方面介绍了红薯的科学管理技术,确保红薯优质高产。     

无铜饲料对小鼠肠道菌群的影响

铜是动物机体必需的金属元素,参与重要的代谢反应。本试验旨在研究无铜饲料对小鼠肠道微生物菌落组成和相关代谢通路的影响,选择健康、体重相近、遗传背景为野生型C57BL/6J的成年公鼠20只,随机分为2组,试验组和对照组各10只。待小鼠适应性饲养1周后用无铜饲料饲喂,对照组饲喂25 mg/L含铜水,试验组饲喂无铜水,试验期30 d。试验期结束时,尾静脉采血进行铜蓝蛋白含量的测定,并采集小鼠新鲜盲肠内容物利用高通量测序技术对小鼠的盲肠内容物16S rRNA基因组进行分析。结果显示,与对照组相比,无铜组小鼠血清铜蓝蛋白含量极显著降低（P < 0.001）。无铜组小鼠盲肠微生物菌群在门、属水平分别与对照组有5和43个差异显著菌群（P < 0.05）;通过差异菌群功能预测分析发现,两组共有19种KEGG二级代谢通路差异显著（P<0.05）,其中与代谢相关的功能是脂代谢、甘氨酸生物合成与代谢、多酮类化合物和萜类化合物代谢、其他次生代谢产物的生物合成和氨基酸代谢,说明饲料中铜的缺失可以改变少数肠道菌群的组成及其功能,本试验为研究铜在小鼠肠道菌群结构及代谢中的功能提供了重要思路。     

急性冷刺激后巴马猪背膘和腹股沟皮下脂肪组织的脂质组比较

本研究旨在获得巴马猪皮下脂肪组织（包括背膘（backfat）和腹股沟皮下脂肪组织（inguinal subcutaneous white adipose tissue，iWAT））在急性冷刺激（4 ℃、4 h）后其脂质组成应答的差异。正常饲喂的6月龄巴马公猪在急性冷刺激处理后进行屠宰，收集背膘和腹股沟皮下脂肪组织，利用液相二级质谱（LC-MS/MS）高通量脂质组学检测技术分析其脂质组成。结果表明，在巴马猪皮下脂肪组织中，中性脂类、游离脂肪酸、磷脂类和鞘脂类4大类脂质含量差异巨大，其中含量最高的为中性脂类，在腹股沟皮下脂肪组织和背膘中分别占4大脂类总和的97.43%和98.53%；含量最低的为鞘脂类，在腹股沟皮下脂肪组织和背膘中所占比例分别为0.10%和0.07%。在16亚类脂质组成中含量最高的脂质为甘油三酯，在腹股沟皮下脂肪组织和背膘分别占16亚类脂质总和的95.97%和97.33%；含量最低的脂质为磷脂酸，在腹股沟皮下脂肪组织和背膘中所占比例分别为3.98E-04%和1.13E-04%。主成分分析表明，背膘和腹股沟皮下脂肪组织在急性冷刺激后脂质组成存在差异。以∣差异倍数∣>1.5和P<0.05为标准筛选，共获得18种差异显著的脂类，其中16种脂类在背膘中含量显著低于腹股沟皮下脂肪组织，其中包括14种甘油三酯、DAG32：1（16：1/16：0）和PE40：6p；只有2种脂质（CL74：8（18：2）和TAG54：3（16：0））在背膘中的含量显著高于腹股沟皮下。巴马猪皮下脂肪主要脂质组成为甘油三酯；急性冷刺激后，背膘和腹股沟皮下脂肪组织对急性冷刺激存在不同的应答。     

RNF20及其介导的组蛋白H2B单泛素化对小鼠棕色脂肪细胞分化的影响

旨在研究RNF20及其介导的组蛋白H2B第120位赖氨酸的单泛素化（H2Bub）对小鼠棕色脂肪细胞成脂分化的影响。采集1日龄和2月龄雄性C57BL/6小鼠的棕色脂肪组织（n=3），用Western blot方法检测RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。利用胶原酶消化法分离获得1日龄小鼠的棕色前体脂肪细胞。分别诱导棕色前体脂肪细胞和C3H10T1/2细胞系成脂分化，通过油红O染色检测其分化效果，进一步通过Western blot检测细胞分化前后（0和8 d）RNF20的表达及其介导的H2Bub水平。通过siRNA干扰Rnf20基因在C3H10T1/2细胞系中的表达，油红O染色方法观察Rnf20基因对成脂分化的影响，利用qPCR和Western blot技术检测Rnf20基因的干扰效率及其介导的H2Bub水平。结果显示，2月龄小鼠棕色脂肪组织中RNF20表达量及其介导的H2Bub水平均显著高于1日龄小鼠。脂肪细胞分化标记蛋白PPARγ和CEBPα的表达水平，RNF20表达量及其介导的H2Bub水平在棕色前体脂肪细胞及C3H10T1/2细胞成脂分化后均显著增加。此外，在C3H10T1/2细胞中敲降Rnf20基因后，与阴性对照组相比，RNF20及其介导的H2Bub水平显著降低，成脂分化后脂滴明显减少。综上表明，RNF20对小鼠棕色脂肪细胞的分化是必需的，敲降Rnf20基因导致组蛋白H2Bub水平显著降低，且降低了C3H10T1/2细胞的成脂分化效率。本研究丰富了小鼠棕色脂肪细胞分化过程中的表观遗传调控研究，为深入理解动物脂肪细胞分化提供了新的基因素材。     

植物耐盐转基因研究进展

盐分是影响植物生长、发育和作物产量的主要非生物因素.耐盐是一个复杂的生理生化过程,且涉及到行使多种功能基因家族的作用,如离子隔离、代谢调节、渗透压调节和抗氧化防御.与传统的耐盐突变体筛选相比,转基因耐盐工程是更直接有效的方法,本文归纳了近年来植物耐盐基因工程的研究进展.     

鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响

研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1（UCP1）基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度（0、5、20、50和100 μg/mL）鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5（Myf5）、生肌决定因子（MyoD）、肌细胞生成素（Myogenin）、生肌调节因子4（MRF4）的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6 d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度。用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6 d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2 d细胞的活力。结果发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加（P<0.05）;血清鞘磷脂含量差异不显著（P>0.05）;不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响（P>0.05）;成肌分化6 d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因Myf5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调（P<0.01）;与未添加鞘磷脂的对照组相比,20 μg/mL鞘磷脂组有更多肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加（P<0.05）,Myogenin、MRF4基因的表达量显著提高（P<0.05）。利用20 μg/mL鞘磷脂诱导细胞分化,在分化2 d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组（P<0.05）,细胞活力也显著高于对照组（P<0.05）;分化6 d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组（P<0.05）。本研究结果表明,20 μg/mL鞘磷脂能够提高小鼠肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考。