AANAT基因在滩羊不同繁殖时期卵巢中的转录差异及DNA甲基化程度分析

试验旨在检测5-羟色胺-N-乙酰基转移酶（AANAT）基因在绵羊休情季节和繁殖季节（卵泡期和黄体期）卵巢组织中的转录差异,并分析转录差异是否由DNA甲基化修饰程度改变所导致。试验采用自然环境条件和饲养管理一致,且体重差异在0.5 kg范围内的空怀母滩羊作为试验动物,采集其休情期、卵泡期和黄体期（每个时期3只）的卵巢组织,采用SYBR染料法进行实时荧光定量PCR检测AANAT基因在滩羊不同繁殖时期卵巢组织中的转录水平。随后针对转录水平有差异的两个时期（休情期和卵泡期）的样本,利用MethPrimer 2.0在线软件预测AANAT基因启动子区和第一外显子区的CpG岛;用重亚硫酸盐测序法（BSP法）检测AANAT基因启动子区及第一外显子区的甲基化程度。试验结果显示,滩羊休情期卵巢组织中AANAT基因转录水平显著低于卵泡期的AANAT基因转录水平（P<0.05）,休情期与黄体期滩羊卵巢组织中AANAT基因的转录水平差异不显著（P>0.05）。滩羊卵巢组织中AANAT基因启动子区上存在着一个长度为173 bp的CpG岛,第一外显子区存在着一个长度为118 bp的CG岛。然而,两个甲基化岛区内的单个CpG位点甲基化程度在滩羊休情期和卵泡期之间均不存在显著差异,暗示AANAT基因的表达受甲基化修饰外的因素调控。本研究结果可为进一步探讨AANAT基因在季节性发情和卵泡成熟中的功能提供参考资料。     

绵羊SPP1和PLCB3基因多态性与产羔数的关联分析

试验旨在探究SPP1基因g.36651870T>C位点多态性、PLCB3基因g.41871219T>C位点多态性与绵羊产羔数之间的关系,以期寻找绵羊产羔数性状相关的分子标记。利用全基因组重测序结合Sequenom MassARRAY誖SNP技术对多羔羊(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊)和单羔羊(滩羊、苏尼特羊、萨福克羊和草原型藏羊)7个绵羊品种SPP1、PLCB3基因的2个位点进行多态性检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:2个位点均存在TT、TC和CC三种基因型。SPP1基因g.36651870T>C位点的基因型频率和等位基因频率在两类绵羊品种间差异极显著(P<0.01);PLCB3基因g.41871219T>C位点基因型频率在两类绵羊品种间差异不显著(P>0.05),等位基因频率差异显著(P<0.05)。群体遗传学分析表明,SPP1基因g.36651870T>C位点在小尾寒羊、苏尼特羊、萨福克羊和湖羊中均表现为中度多态(0.25≤PIC<0.5),在滩羊、策勒黑羊和草原型藏羊中表现为低度多态(PIC<0.25);PLCB3基因g.41871219T>C位点在滩羊中表现为中度多态(0.25≤PIC<0.5),在其余6个绵羊品种中均表现为低度多态(PIC<0.25)。卡方适合性检验表明,SPP1基因g.36651870T>C位点在7个绵羊品种中均处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05);PLCB3基因g.41871219T>C位点在小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、草原型藏羊5个品种中处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05)。关联分析表明,PLCB3基因g.41871219T>C位点多态性与小尾寒羊第1胎产羔数有显著关联(P<0.05),TT基因型个体产羔数显著高于CC基因型个体;SPP1基因g.36651870T>C位点多态性与小尾寒羊不同胎次产羔数之间无显著关联(P>0.05)。综上,PLCB3基因g.41871219T>C位点对小尾寒羊产羔数性状选育具有一定的参考意义,SPP1基因g.36651870T>C位点不适用于小尾寒羊产羔数性状选育。     

不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs序列特征及表达差异分析

为了分析绵羊卵巢组织中piRNAs的序列特征及不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs的表达差异,本试验采用Solexa测序技术对休情季节（休情期）和发情季节（卵泡期和黄体期）滩羊卵巢组织进行高通量测序,采用生物信息学方法筛选绵羊卵巢中的piRNAs,对piRNAs的长度分布、首位碱基偏好、基因组来源、染色体分布、链特异性、ping-pong循环特征、piRNAs比对重复序列类型进行分析,并对发情季节与休情季节绵羊卵巢之间差异表达的piRNAs进行靶基因预测及其靶基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析。结果显示,绵羊卵巢中不同长度的piRNAs首位碱基偏好性不一致;3个时期（休情期、黄体期和卵泡期）的piRNAs均主要比对到基因内含子、编码区及lncRNA区域,而比对到重复序列的piRNAs相对较少;绵羊卵巢piRNAs在染色体上呈不均匀分布;绵羊piRNAs簇存在很强的链特异性,但首位碱基偏好性不明显;3个时期的piRNAs均无明显的ping-pong循环特征。KEGG富集分析发现,差异piRNA靶基因主要富集在RNA运输通路（RNA transport pathway）、嘌呤代谢通路（purine metabolism pathway）、黏着斑通路（focal adhesion）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）等与绵羊繁殖相关的通路。本研究揭示了不同繁殖季节绵羊卵巢组织中的piRNAs序列特征,暗示绵羊卵巢组织中的piRNAs可能通过BAD等基因和黏着斑通路等调控绵羊季节性繁殖,为深入解析绵羊季节性发情分子机制提供一定参考。     

TAC1和PRLR基因在绵羊不同繁殖状态下的表达模式分析

旨在进一步揭示TAC1和PRLR基因在绵羊季节性发情调控和繁殖时期转换中的作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析TAC1和PRLR基因在不同光照条件下的成年苏尼特母羊(季节性发情品种)和处于不同繁殖时期的成年小尾寒羊母羊(常年发情品种)10种组织(下丘脑、垂体、松果体、大脑、小脑、卵巢、子宫体、输卵管、肾、肾上腺)中的表达模式。结果表明:1)TAC1和PRLR基因在两品种绵羊10种组织中均有表达,且组织表达特征基本一致,TAC1基因主要表达于性腺轴组织,PRLR基因主要在垂体和肾上腺中表达。2)TAC1和PRLR基因在长光照(LP)条件下苏尼特羊各组织中的表达量均高于短光照(SP)下表达量,在小尾寒羊大多数组织中黄体期表达量高于卵泡期。3)由短光照转换为长光照后,TAC1基因在苏尼特羊垂体中的表达量缓慢增加,在长光照49天时表达量极显著高于短光照和其它长光照时间点(P0.01);PRLR基因在苏尼特羊垂体中表达量从LP3D开始显著升高(P0.05),至LP21D时达到峰值,下丘脑中表达量从LP15D开始显著高于短光照(P0.05),且有持续升高的趋势。以上结果暗示了TAC1和PRLR基因可能涉及绵羊季节性繁殖和繁殖时期转换的调控,明确了它们发挥作用的主要组织,同时揭示了这2个基因由短光照转换为长光照后的表达变化趋势,发现PRLR基因在垂体和下丘脑中具有不同的响应模式。     

EYA 3和TSH β在季节性发情和常年发情绵羊中的表达模式

本研究旨在揭示EYA3和TSHβ两个基因在绵羊季节性发情调控和繁殖时期转换中的作用。采用qPCR技术分析眼缺失基因3(Eyes absent 3,EYA3)与促甲状腺激素β亚基基因(Thyrotrophinβsubunit,TSHβ)在不同光照条件下(长光照和短光照)季节性发情的苏尼特羊(Sunite sheep,SNT)和不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)常年发情的小尾寒羊(Small Tail Han sheep,STH)各组织中的表达模式。结果表明,EYA3基因在两个品种绵羊各组织中广泛表达,TSHβ基因仅在绵羊垂体中高表达;在绝大多数组织中,两基因在苏尼特羊中表达量为长光照(Long photoperiod,LP)高于短光照(Short photoperiod,SP),而在小尾寒羊中是黄体期高于卵泡期;SP转至LP时,苏尼特羊垂体中EYA3与TSHβ的表达量均升高,在长光照第3天(Long photoperiod 3,LP 3)EYA3表达量达到最高,在LP 21时,TSHβ表达量达到最高,EYA3表达量提前于TSHβ开始降低。本研究揭示了EYA3与TSHβ在常年发情和季节性发情绵羊中的表达谱特征,不同光照条件与不同繁殖时期绵羊松果体与垂体中上述基因的表达模式,暗示EYA3可能也在松果体部位发挥作用,并对绵羊季节性发情进行调控,EYA3与TSHβ两个基因也可能参与发情时期的转换;SP转变为LP过程中,EYA3早于TSHβ发挥调控作用。     

阿勒泰羊臀脂沉积性状4个候选基因的表达及分析

阿勒泰羊的抗寒性能与其肥硕的尾脂(臀脂)高度相关。试验旨在通过检测影响脂肪沉积相关基因THRSP、CEBPα、PRKAG3和SREBF1的组织表达模式,期望寻找到影响阿勒泰羊臀脂沉积的关键基因,为进一步阐明绵羊臀脂沉积的分子调控机理提供参考。采集3只3岁健康阿勒泰母羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮下脂肪、尾脂8个组织,运用荧光定量PCR技术对上述基因在以上各个组织中的表达情况进行分析。结果表明,THRSP和CEBPα基因在阿勒泰羊肝、皮下脂肪和尾脂中的表达量显著高于其他组织(P0.01),暗示此2个基因可能与脂肪的生成密切相关。PRKAG3基因在脂肪合成组织中低表达(P0.01),提示其可能与脂肪的分解密切相关。研究结果为进一步阐明阿勒泰羊臀脂消长的生物学现象提供了科学思路。     

西藏山羊高海拔适应性的选择信号筛选

试验旨在对西藏山羊常染色体的选择信号进行筛选,发掘重要的种质特性基因。基于西藏山羊、新疆山羊和太行山羊群体的Illumina 50K芯片分型数据,通过过滤等位基因频率较低和未定位的变异位点,得到高质量的SNPs标记;通过计算遗传分化系数（Fst）来分析群体遗传结构,同时对群体进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和系统进化树构建以确定其群体结构;借助Di和XP-EHH两种不同的方法,以前5%为阈值,通过SNPs注释得到西藏山羊基因组受选择基因,并利用相关的生物信息学数据分析库对候选基因进行功能富集分析。结果显示,在3个群体中共鉴定出48 358个SNPs标记,3个群体有相近的遗传距离（Fst<0.05）,西藏山羊的遗传分化程度（Fst=0.0376）明显高于新疆山羊（Fst=0.0256）、太行山羊（Fst=0.0257）,表明西藏山羊群体已经产生一定程度的遗传分化。通过选择信号分析,在西藏山羊群体中共筛选到36个受到较强选择的位点和211个候选基因,其中EGFR、AKT1、PDHB和PFKP等基因与高海拔适应性相关。这些基因主要富集在嘌呤代谢通路、代谢途径和HIF-1信号通路等。利用基因组SNP标记可以更全面地揭示西藏山羊高海拔适应性的选择进展,为种质资源的保护和利用提供重要参考。     

促黄体素β基因多态性与小尾寒羊产羔数相关性分析

采用PCR-SSCP和测序技术检测促黄体素β亚基基因5′调控区和3个外显子序列在小尾寒羊、多赛特羊、萨福克羊和乌珠穆沁羊中的单核苷酸多态性,分析其多态性与小尾寒羊产羔数的相关性。结果表明:引物P2、P4和P5扩增片段均存在多态性。引物P2对应的突变[A(-424)G、T(-271)C]以及引物P4对应的突变[G(-6)A]均会引起调控区结合因子的显著变化。对于P2座位,AA型小尾寒羊产羔数显著高于其余基因型,其余基因型之间小尾寒羊产羔数差异均不显著;对于P4和P5座位,各基因型之间小尾寒羊产羔数差异均不显著。由此推断该基因5′调控区序列A(-424)G和T(-271)C的单碱基突变可能是提高小尾寒羊产羔数潜在的有效标记。     

山羊DPYD和NAV3基因多态性与产羔性能的关联分析

为分析二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)和神经导航因子3(NAV3)基因的单核苷酸多态性与山羊产羔性能的关联性,通过MassARRAY?SNP分型技术对DPYD基因和NAV3基因的4个候选位点进行分型,探究其在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊3个群体中的遗传学特征,并统计其与云上黑山羊的产羔性能(产羔数、初生窝重、断奶窝重)...