桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.     

甘蔗光合系统Ⅰ psaD基因的克隆和表达分析

采用RACE-PCR方法,以甘蔗心叶为材料克隆了甘蔗PSⅠ反应中心亚基Ⅱ基因全长,命名为SopsaD,GenBank登录号JX866950。该基因cDNA序列全长为904bp,编码200个氨基酸多肽,预测其分子质量和等电点分别为21.85ku和10.5,其中N端的1~44aa是叶绿体转运肽序列,62~199aa是保守的Pfam:PasD结构域。SopsaD与玉米(EU953246)、水稻(AY224449)、大麦(M98254)和短柄草(XM003564060)psaD基因核苷酸同源性分别为85%、85%、84%和81%,氨基酸序列的同源性分别为92%、88%、87%和85%。荧光定量PCR表明甘蔗在叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SopsaD基因表达,其中在叶中表达量最高,其次是花序中,而在根中的表达量最低。甘蔗在工艺成熟期和生理成熟期SopsaD基因整体上表现为功能叶中基因表达量高,而老叶中基因表达量低,证实该基因参与光合作用反应。     

高、低糖甘蔗品种伸长期糖分积累特征及代谢相关酶活性分析

为了探究高、低糖甘蔗品种伸长期蔗糖代谢相关酶与糖分积累的相关性,采用桶栽试验,对甘蔗高糖(GT35)和低糖(B8)品种伸长期不同成熟度的叶和茎中的蔗糖合成方向和分解方向酶的酶活性、蔗糖、葡萄糖和果糖含量进行分析。结果表明,2个品种叶中蔗糖和己糖含量与NI酶活性呈显著正相关,茎中蔗糖含量与SPS和CIN酶活性呈显著正相关,与SS-c、SAI和NI酶活性呈显著负相关。GT35在成熟茎和老茎中蔗糖含量显著高于B8,己糖含量则显著低于B8。GT35中酶活性显著高于低糖B8的酶有成熟叶中的SPS、SS-c和SAI,老叶中的SPS、SS-c、NI和CIN,幼叶中的SS-s和NI,成熟茎中的SPS和CIN,老茎中的SPS、SS-s和CIN以及幼茎中的SS-c和CIN。B8中酶活性显著高于GT35的酶有幼叶中的SS-c、SAI和CIN,成熟叶中的SAI和CIN,老叶中的SAI和SS-s,幼茎中的SAI、SS-s和NI,成熟茎中的SS-s、SS-c和SAI,老茎中的NI。基于以上结果,认为叶中高SPS和NI酶活性,茎中SPS和CIN酶活性高,SAI、SS-c和NI酶活性低,可能是调节伸长期高糖甘蔗品种茎中蔗糖积累的重要因素。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

低温胁迫对不同耐寒型甘蔗蔗糖代谢相关酶基因表达及其酶活性的影响

[目的]研究不同耐寒型甘蔗品种叶片中蔗糖代谢关键酶基因表达及其酶活性在低温胁迫条件下的变化,为培育高产高糖、抗寒性强甘蔗新品种提供参考.[方法]以耐寒型甘蔗品种GT28和冷敏感型品种ROC22为材料,幼苗期进行6℃低温胁迫处理0（对照）、2、5、9 d及胁迫处理5和9d后恢复生长2d,分析两品种甘蔗＋1位叶叶片蔗糖代谢关键酶基因表达及相关酶活性.[结果]与对照相比,低温胁迫利于诱导GT28相关酶基因的表达,而抑制ROC22相关酶基因的表达.6℃低温胁迫2、5、9 d后,GT28叶片SAI、CIN和SPS1基因相对表达量呈先降低后升高的变化趋势,而SPS2和SS表达量呈逐渐升高的趋势,分别以低温胁迫2和9d最高,为对照的8.31、6.99、3.80、5.27和1.65倍;冷敏感型ROC22叶片SAI、CI和SPS2基因相对表达量呈不断下降的变化趋势,以胁迫2d的相对表达量最高,分别为对照的9.79、5.37和4.711倍,而SPS1和SS相对表达量分别呈上升、先上升后下降的变化趋势.低温胁迫5d后恢复生长2d的ROC22叶片SAI、CIN、SPS1和SS及GT28叶片SPS1和SPS2基因相对表达量明显高于胁迫9d后恢复生长2d的处理,而GT28叶片SAI、CI和SS的表现相反.在胁迫5、9d后恢复生长2d,ROC22叶片CIN、SPS2均有所上升,GT28叶片SAI、SPS1和SS相对表达量均有所下降.与对照相比,低温胁迫2～9 d可不同程度提高不同基因型甘蔗品种叶片AI、NI、SPS和SS酶活性,AI和NI酶活性以GT28叶片相对较高,而SPS和SS酶活性以ROC22叶片表现更高.随胁迫时间的延长（2～9d）,GT28叶片的AI、SPS和SS酶活性均呈逐渐上升的变化趋势,以胁迫处理9 d最高,分别为161.62 μmol Glc/gFW·h、7.88和14.28μmol Suc/gFW·h,而NI酶活性以胁迫处理2 d最高（472.49 μmol Glc/gFW·h）.ROC22叶片AI和NI酶活性随胁迫时间的延长而逐渐降低,均以胁迫处理2d的最高,胁迫处理9d的最低;SPS和SS酶活性则表现为先上升后下降的变化趋势,以?