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伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组经AscⅠ酶切获得含PK基因的8.7kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ位点,获得中间载体P8-AA,将LacZ表达盒插入其SphⅠ/NdeⅠ位点,构建重组转移载体P8AA-lacZ,将其与伪狂犬病病毒TKˉ/gIˉ株基因组共转染PK-15细胞,细胞出现病变后通过覆盖含有X-gal的营养琼脂进行蓝白斑筛选,通过蚀斑克隆方法分离到重组体PRV(rPRV),且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-半乳糖苷酶活性。通过对重组病毒PRV-LacZ和亲本株TKˉ/gIˉ株TCID50的试验表明,PK基因的缺失对病毒增殖无影响。 相似文献
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为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。 相似文献
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不同年限设施菜地番茄细胞壁果胶Cd累积的研究 总被引:3,自引:3,他引:0
为探讨不同种植年限和设施菜地番茄细胞壁果胶Cd累积的关系,以种植年限为2年和14年设施菜地番茄为研究对象,测定了不同种植年限下番茄茎、叶细胞壁果胶含量,并对细胞壁果胶含量、果胶甲酯酶(PME)活性与种植年限及Cd累积量之间的相关性进行了分析。结果表明,随着种植年限的增加,番茄植株各器官Cd累积量均有所增加;种植14年设施菜地番茄茎中Cd累积量比种植2年的增加了24.55%,叶片中Cd累积量增加了45.96%;种植14年设施菜地番茄茎细胞壁Cd累积量增加了61.86%,叶片细胞壁Cd累积量增加了57.46%;不同种植年限设施菜地番茄茎和叶细胞壁果胶Cd含量也存在极显著差异(P0.05)。另外,随着种植年限的增加,番茄茎、叶细胞壁果胶含量和PME活性随之升高:与种植2年相比,种植14年设施菜地番茄茎中果胶含量提高了104.51%,叶片果胶含量提高了127.45%;种植14年设施菜地番茄茎中PME活性提高了10.56%,叶片PME活性提高了9.39%。果胶含量及PME活性和细胞壁Cd累积量呈正相关。研究发现不同年限设施菜地土壤全Cd和有效Cd含量有所不同,影响着番茄不同器官果胶含量及PME活性,说明细胞壁果胶在缓解番茄Cd毒害中起着一定的作用。 相似文献
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【目的】探索tva受体基因起始密码子突变(tva c.3G>A)对鸡感染A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A, ALV-A)的影响。【方法】利用Sanger测序和RT-PCR验证我国黄羽肉鸡存在tva c.3G>A突变。利用流式细胞术检测tva c.3G>A突变对鸡体外感染RCASBP(A)-GFP荧光报告病毒的影响。通过ALV-A体内攻毒试验,探究tva c.3G>A突变对鸡体内感染ALV-A的影响。利用直接测序方法对我国黄羽肉鸡品系tva c.3G>A突变位点进行基因分型。【结果】Sanger测序和RT-PCR结果鉴定我国黄羽肉鸡品系tva基因编码区第3位碱基由G突变为A,该突变引起tva基因起始密码子序列由ATG突变为ATA。流式细胞术检测结果显示野生型tva c.3G/G鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast, CEF)对RCASBP(A)-GFP易感,纯合突变型tva c.3A/A CEF抗RCASBP(A)-GFP感染,表明tva c.3G>A突变导致鸡体外抗RCA... 相似文献