谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

【目的】谷子(Setaria italica L.)具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子,为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式;通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位;在拟南芥中过表达SiNAC18,分析SiNAC18的生物学功能;分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp,编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为38.8 k D;系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,与拟南芥基因At NAC29同源性最高;氨基酸序列比对结果显示,SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域,蛋白C端具有高度多态性,证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关;real-time PCR结果显示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高盐(Na Cl)及过氧化氢(H2O2)处理条件下的表达量明显上升;亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在ABA和PEG胁迫处理下,SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异:在正常生长条件下,野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致,在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上,SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5μmol·L-1 ABA处理条件下,转基因拟南芥的萌发率显著低于WT;下游基因表达分析结果显示,ABA信号途径相关基因At RD29A,脯氨酸合成相关基因At P5CR和At PRODH以及过氧化物酶基因At PRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量,表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。     

不同水分胁迫下转W16小麦回交株系基因表达特性及其抗旱机制

干旱应答元件结合蛋白(DREB)转录因子调控植物抗逆相关功能基因的表达,对提高植物抗逆境胁迫具有重要作用.本研究采用盆栽法在小麦(Tritium aestivum)拔节至抽穗期进行不同水分胁迫条件下,分析了野生型和转基因小麦回交株系转录因子基因W16的表达特点,并对其抗旱性的生理生化指标进行了测定.半定量RT-PCR结果表明:野生型在无干旱胁迫时,W16有微弱表达,随胁迫增强,表达上调,当表达量达到峰值后(12 h),随胁迫的加剧,表达量迅速下降,呈现“上升-峰值-下降”特点,而整个干旱胁迫过程中转基因植株W16在Ubiquitin启动子作用下表达恒定且表达水平较高;抗旱性生理生化机制分析表明:不同水分胁迫条件下,转基因株系的叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、水分利用效率的变化均高于受体对照,尤其在重度干旱(SD)胁迫下的差异更显著.产量结果显示,在各水分条件下转基因株系产量都高于受体对照,其抗旱指数属于较强抗旱等级.研究结果说明了转基因小麦回交株系中W16的超表达,改良了转基因小麦抗旱性的生理生化特性,提高了转基因小麦的抗旱性能.为抗旱转基因小麦品种选育提供理论和方法参考.     

小麦转基因技术研究及其应用

近年来植物转基因技术研究迅速发展,大豆、玉米、油菜和棉花等转基因品种已大面积推广应用,取得巨大的经济和社会效益。小麦是世界上主要的粮食作物,自1992年第一株转基因小麦诞生以来,小麦转基因技术发展较快,为开展小麦分子育种奠定了基础。目前,小麦遗传转化主要采用基因枪法和农杆菌介导法,分别占68.8%和15.9%。研究涉及抗病、抗虫、抗逆、品质改良、提高产量等方面,其中研究较多的为抗病(39.7%)和品质改良(25.6%),部分转基因小麦品系已进行环境释放及生产性试验。本文综述了小麦转基因技术的发展和应用现状,讨论了小麦转基因研究存在的主要问题和今后的发展方向。     

抗旱转基因小麦(Triticum aestivum L.) 的杂草性评价

【目的】全球转基因作物商业化迅猛发展,包括杂草化在内的一系列生态风险评估和研究尤为重要。文章中系统评价抗旱转基因小麦MGX-L大面积推广种植可能带来的演化为杂草的生态风险,为转基因抗旱小麦的环境安全评价标准制定提供科学依据。【方法】通过比较荒地和栽培地上抗旱转基因小麦、受体小麦和当地常规品种的农艺性状,评价转基因小麦的生存竞争能力;并比较荒地上生存的转基因小麦与受体的繁殖系数,评价转基因小麦群体在野外的生存能力。比较转基因小麦和受体品种的自生苗比率、种子落粒性、及深埋和浅埋地下种子萌发情况,评价转基因小麦的自然延续能力。比较转基因小麦和受体品种的花粉活力、花粉大小和花粉育性,评价转基因小麦的自然繁育能力。综合分析以上各项评价结果,评价抗旱转基因小麦演变为杂草的可能性。【结果】转基因小麦在栽培地上种植,其株高、总穗数和穗粒数与受体品种相比,没有显著差异,而转基因小麦的产量、千粒重显著高于受体品种。但和其他非转基因当地主栽小麦品种相比,或没有显著差异,或低于其他非转基因小麦品种,因此,转基因小麦与其非转基因小麦对照相似,在栽培地种植没有更强的生存竞争能力。在荒地环境下,转基因小麦生存竞争能力和受体品种没有显著差异。在荒地上种植且成熟的转基因小麦,单位面积内收获的总籽粒数少于上一年种下的种子粒数,其繁殖系数低于1。转基因小麦群体不可能在野外环境中自然维持下去。转基因小麦种子的落粒性和产生自生苗比率与受体品种相比没有显著差异。深埋20 cm以下土层的转基因小麦和受体品种的种子全部腐烂;浅埋3 cm土层的转基因小麦和受体品种的种子或者腐烂或者出苗,没有发现未萌发且保存完好能够保持活力继续发芽的种子,二者的种子腐烂或出苗的比率没有显著差异,说明转基因小麦和受体品种种子的延续能力低且无显著差异。【结论】转基因抗旱小麦MGX-L与其受体对照品种济麦22及其他非转基因当地主栽品种相似,耐旱性状的引入不会增加小麦的杂草化潜势。     

盐响应信号途径SOS与植物K+吸收关系

【目的】在盐胁迫条件下研究SOS突变体K+吸收的变化,旨在解析植物高盐胁迫响应与K+吸收的关系。【方法】以SOS信号途径的3个主要基因sos1、sos2、sos3突变体和野生型拟南芥（WT）为试验材料,在含有不同Na+/K+浓度比例的培养基上处理试验材料,观察各突变体与WT的表型差异,进行根系扫描、测定植物的RGR（相对生长率）,植株体内Na+、K+的含量,计算植株体内Na+/K+浓度比值,同时,利用qRT-PCR分析K+转运体基因AKT1、AKT2、SKOR在突变体和WT间的表达差异。【结果】不同浓度K+进行处理时,突变体和WT之间没有明显差异;在30 mmol•L-1 NaCl处理下,植株形态、RGR和体内Na+/K+浓度比值,体内K+浓度的测定结果显示,当K+浓度从0.2 mmol•L-1 增加到60 mmol•L-1 时,K+浓度增加缓解了高盐胁迫对突变体生长的抑制作用。所有植株体内的Na+/K+值降低,体内K+浓度提高。在相同处理条件下,突变体的Na+/K+值高于WT,WT体内K+浓度高于突变体;当K+浓度升高到80 mmol•L-1 时,突变体的生长又重新受到抑制。所有植株体内的Na+/K+值升高,体内K+浓度降低。3个K+转运体AKT1、AKT2、SKOR的real-time PCR分析结果显示,在30 mmol•L-1 NaCl处理时,在低钾条件下（0.2 mmol•L-1 K+）AKT1和SKOR表达比较低,而高钾条件下（20.05 mmol•L-1 K+或者60 mmol•L-1 K+）AKT1、AKT2、SKOR的表达量没有明显差异,这3个基因的表达方式在突变体之间没有明显的差异。【结论】在中度盐胁迫条件下,外界K+浓度增加可以缓解盐胁迫对植物生长造成的抑制作用,但是当外界一价阳离子的总浓度高于110 mmol•L-1时,拟南芥的生长重新受到抑制。SOS信号途径对植物K+吸收没有直接的调节作用。     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

豌豆终止子rbc-T在转基因小麦研究中的应用

目前常用的转基因载体元件大多为真菌或细菌来源,引发对转基因食品安全性的担忧。本研究克隆了豌豆终止子rbc-T,并用其替换农杆菌终止子nos-T构建转化载体,利用基因枪法将携带Ubi启动子、GUS基因和终止子rbc-T组成的最小表达框片段转化普通小麦,同时以带有nos-T终止子的载体为对照,经过PCR检测筛选获得T2代稳定遗传的转基因小麦株系。GUS组织化学染色及酶活定量分析结果表明,带有nos-T及rbc-T的转基因小麦中均能检测到GUS基因不同程度的表达。因此认为,豌豆终止子rbc-T可以代替农杆菌终止子nos-T用于小麦的转基因研究。     

大豆NF-YB家族全基因组鉴定、分类和表达

利用大豆基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定大豆NF-YB家族基因的全序列、定位和拷贝数,通过序列比对进行进化和分类分析。利用大豆高通量RNA测序数据、NCBI中UniGene的EST表达数据进行组织表达谱分析。结果表明,大豆基因组中含有28个NF-YB家族基因,分布于大豆的14条染色体上,系统进化树分析将其分成3类。启动子分析表明,几乎全部NF-YB家族基因的启动子区均含有逆境应答反应顺式作用元件。各个发育阶段中,多数成员至少在一个组织中表达,10个差异表达的基因中有2个在根瘤中特异表达,2个在根中特异表达,2个在根瘤中优势表达,另外4个在其他部位优势表达。研究结果促进了NF-YB家族基因的功能研究与利用。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。