棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。     

陆地棉基因型间竞争对产量及构成因素的影响

利用陆地棉色素腺体作为指示性状，采用４个遗传差异较大的品种研究了在基因型竞争条件下陆地棉植株性状的变化。结果表明，纯型种植时高产的基因型，在品种混合体中不同基因型竞争下生产力下降，而低产基因型的生产力则有所提高。品种产量越高，由其组成的混合体比预期值减产越多。品种混合体的产量均未超过其组成中的高产品种，多数品种混合体的产量均低于预期值。籽棉产量、皮棉产量、单株结铃数均具有明显的竞争效应和趋势，单铃重、衣分无明显的竞争趋势。     

海岛棉抗黄萎病基因SSR标记研究

以高抗黄萎病的海岛棉品种Pima 90-53和高感黄萎病的陆地棉品种中棉所8号的182个F2单株为标记群体,在田间病圃中鉴定F2单株,并通过培养室人工接菌法鉴定F2:3家系,以进一步确定相应F2单株的抗病性,经χ2c适合性测验,抗病、感病植株比例符合3∶1。采用混合分组分析法(BSA)对768对SSR引物进行筛选,发现引物BNL2440和BNL3255在抗、感DNA池呈现多态性,其中BNL3255在抗、感DNA池之间扩增出一条大小为208bp的多态性片段,定名为BNL3255-208。以Mapmaker/Exp(Version3.0b)软件分析F2单株检测结果,BNL3255-208标记与棉花黄萎病抗性位点之间的遗传距离为13.7 cM。     

中国短季低酚棉遗传资源初步研究

本文对我国生产上应用的短季低酚棉品种及近几年参加各区域试验的新品系４０份材料进行农艺性状和品质特性分析研究，并与当前在黄河流域推广的短季低酚棉品种中无２６８进行了系统比较。结果表明，该资源群体单株结铃数平均值仅有１４．３个，与推广品种中无２６８相比偏少。单铃重平均值为５．９ｇ，远大于推广品种中无２６８；衣分偏低，平均值为３５．４２％，中无２６８的衣分处于此值附近；２．５％跨长、比强度、马克隆值平均值分别为２８．８ｍｍ，２１．９ｇ／ｔｅｘ，４．５ｍｉｃ。长度基本符合纺织工业要求，无论是群体平均值，还是现今推广品种中元２６８均表现比强度偏低、纤维整齐度较好。生育期平均值１０９．８ｄ，大多数品种在１０５～１１５ｄ范围之内。推广品种中无２６８表现出较短的生育期。蛋白质含量平均值为４０．０７，变幅大，变异潜力小。棉酚含量平均值０．０１６５，符合国际卫生标准。未达国际卫生标准的仅占６．７％。     

黄萎病胁迫下抗病陆地棉茎组织lncRNA的鉴定与分析

黄萎病是造成棉花产量和品质损失最为严重的病害之一。病菌侵染根组织后,通过茎组织扩展至叶,茎组织在寄主抗病菌扩展中起重要作用。长链非编码RNA（lncRNA）作为一种重要的调控分子,通过多种机制参与植物抗病等众多生物过程,因此分析了棉花茎组织lncRNA的抗病功能。对黄萎病菌胁迫下抗病陆地棉茎组织进行转录组测序,鉴定出971条抗病相关lncRNA。进一步分析黄萎病抗性相关lncRNA的表达特征及其对靶mRNA的调控方式,结果表明,棉花茎组织lncRNA响应黄萎病菌侵染具有明显的时序性,并且主要通过反式作用正调控靶mRNA。GO富集分析揭示差异表达lncRNA在细胞膜、胞外和胞内,通过多种分子功能响应黄萎病菌诱导的几丁质、缺水、缺氧等刺激和JA、ABA等植物激素信号,表明棉花茎组织lncRNA在抵御黄萎病菌侵染过程中起重要作用。基于上述结果并结合已有报道,构建了10条抗病相关lncRNA潜在的抗病机制,对深度解析这些lncRNA的抗病机理提供了重要依据。qPCR检测结果进一步揭示了lnc_011764和lnc_010753对其靶基因具有潜在的调控作用。该结果扩展了对抗黄萎病相关lncRNA的认识,为棉花抗黄萎病机制研究提供了新见解。     

海岛棉GH9基因家族成员鉴定及分析

植物GH9基因在细胞壁的生物合成和重塑中起着重要作用,对海岛棉GH9基因进行全基因组鉴定与分析,挖掘其在棉纤维发育中的作用。从海岛棉全基因组中鉴定到53个GH9基因,分析其理化性质、基因结构、染色体分布、进化历程、棉纤维发育过程中表达模式及转录调控。结果表明,53个GbGH9s分为A、B、C三组,定位在22条染色体上;多倍化事件是海岛棉GH9基因家族扩张的主要驱动力,基因复制后经历严格的选择约束;A组多个成员在棉纤维发育整个时期尤其是次生壁加厚期高表达,C组多个成员在棉纤维起始和伸长期优势表达,B组具有相对复杂的表达模式,生长素和乙烯可能在GbGH9s的转录调控中发挥重要作用。此外,通过回交将GbGH9B6导入陆地棉可提高棉纤维强度。海岛棉GH9基因家族成员的鉴定及分析有助于明确其进化和功能,为后续研究提供重要参考。     

棉花GbSTK基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

棉花是重要的经济作物,实现既抗病又早熟是棉花重要的育种目标,但棉花抗病与早熟基因之间的关联性研究报道甚少。本课题组前期鉴定到一个响应黄萎病菌诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GbSTK,可以提高转基因拟南芥的黄萎病抗性。本研究发现多个抗病棉花品种中STK基因的表达量显著高于感病对照品种H208。在抗病品种农大601中沉默STK基因,沉默植株在接菌后20d,其黄萎病抗性显著降低,病情指数由27.5(耐病)升高到63.2(感病),表明该基因正向调控棉花黄萎病抗性。对转GbSTK基因拟南芥表型鉴定发现,其开花时莲座叶片数平均为7.5个,显著低于空载体对照植株(11.9个),转基因植株开花时间较对照平均提早5~7 d。进一步对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现,转基因不同株系中FT和SOC1的表达水平显著高于对照植株,而LFY基因的表达受影响较小,表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。基于酵母双杂交互作蛋白筛选试验,初步获得30个与GbSTK具有互作关系的候选蛋白,为进一步揭示GbSTK的分子调控网络奠定了基础。本研究首次鉴定出可同时提高黄萎病抗性和提早开花的一个功能基因,为棉花抗病早熟遗传改良提供了参考依据。     

黄萎病菌诱导下陆地棉抗病品种SSH文库的构建

 采用抑制差减杂交技术,构建了陆地棉抗病品种冀棉20经黄萎病菌诱导8 h、12 h、24 h、48 h后的混合SSH文库,文库共包含800个阳性克隆。对质粒的酶切和巢式PCR结果表明,插入片段大小平均为400 bp。随机挑选20个阳性克隆进行测序,利用BLASTn和BLASTx进行序列相似性分析,发现20条EST都可以找到功能已知的同源序列,其中在BLASTn比较结果中,功能已知的有12条,占全部EST的60%;BLASTx的比较结果中有14条功能已知,占全部EST的70%。这些同源序列涉及到10种与抗病防御相关的基因,包括丝氨酸/苏氨酸激酶、谷胱甘肽-S-转移酶、乙醇脱氢酶、细胞色素P450、ACC氧化酶等。将这些序列与GenBank dbEST库进行比对,发现75%的EST都可以找到同源性较高的序列,它们都来自于植物在生物与非生物胁迫条件下特异表达的cDNA文库,这些胁迫包括病原菌诱导、低温处理、紫外线照射、热激处理、盐处理、氧胁迫、水杨酸诱导等。     

转基因执虫棉农大棉7号

农大棉7号(原代号农大KB18)由河北农业大学棉花育种研究室以农大32为母本,SGK321为父本选育而成,2006年4月通过河北省农作物品种审定委员会审定,品种审定号:冀审棉20060018号,2006年申报国家新品种保护,申请公告号:20060611.5.     

棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法

本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NRA),探讨了体内法测定棉花叶片NRA的最适条件。通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对NRA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片NRA的最佳条件,即用50 mmol/L的KNO3溶液诱导棉花叶片48 h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35 min后煮沸10 min可以使NRA的活性达到最高。棉花叶片NRA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础。