牙鲆(Paralichthys olivaceus) CD59基因的原核表达与功能探究

本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式.结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高.对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59.该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好.Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达.对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功.选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白pET-32a-CD59的抑菌活性.研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性.本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础.     

利用DD-PCR分离鳗弧菌刺激相关的牙鲆差异cDNA及表达

本研究采用mRNA差异显示技术(mRNA differentid display,DD-PCR)分离得到20个鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导前后差异表达的牙鲆(Paralichthys olivaceus)cDNA片段。通过对差异片段进行回收、再扩增、克隆、测序、序列比对以及验证分析后,得到9个阳性片段,其中2个片段与已知基因高度同源,一个与牙鲆C3补体高度同源,同源性98%,另一个与牙鲆TEGT(睾丸增强基因转录子)基因高度同源,同源性98%;其余7个为新的cDNA片段。基因表达分析表明,这9个差异片段均在处理组、对照组的不同器官和时间段差异表达,而且多数片段经鳗弧菌诱导后都在肝脏、肾脏、脾脏等鱼类主要免疫器官中上调表达,初步推测它们都是和牙鲆免疫或鳗弧菌病相关的基因。对这些基因进一步的功能研究将对牙鲆的抗病育种及养殖业提供重要的参考。     

圆斑星鲽仔鱼变态前消化系统发生的形态学和组织学研究

对初始孵化到孵化后26d（变态前）的圆斑星鲽（Verasper vazriegatus Temminck et Schlegel）仔鱼的消化系统发生进行形态学和组织学研究。研究表明，在水温为12．5～15．5℃时，初始孵化仔鱼消化道细而直，两端封闭，位于卵黄囊背方。随着仔鱼发育，消化道延长，肝胰脏出现。孵化后6d，仔鱼开口，消化道贯通，开始摄食。孵化后10d，消化道明显分为口咽腔、食道、胃、小肠、直肠，黏膜上皮褶皱增多。孵化后14d，卵黄囊消失，仔鱼完全依靠外源性营养。孵化后26d，胃壁较厚处出现胃腺，但不发达，幽门盲囊尚未出现。由结果可见，孵化后6d仔鱼开口，可开始投喂轮虫；孵化后26d，消化系统的结构和功能逐渐完善，消化吸收能力增强，但由于胃的结构和功能尚不完善，此阶段还应以活体饵料为主，一方面可逐渐加大轮虫的投喂量，另一方面可适当投喂较大的卤虫无节幼体等。本研究旨为圆斑星鲽人工育苗中饵料种类及投喂时间的选择提供理论依据。