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21.
[目的]通过优化电穿孔转化技术主要参数,得到候选转基因植株,探索普通小麦(Triticum aestivum L.)电穿孔遗传转化体系.[方法]以冬小麦品种济麦19为受体,GUS为外源基因,将扬花期成熟花粉以最适电场强度和操作温度进行电穿孔处理后,人工授粉济麦19,最终收获种子;利用PCR技术、Southern技术、化学染色方法对T1、T2植株进行鉴定.[结果]电穿孔转化以电场强度6 kV·cm-1、冰上处理花粉,花粉密度为5×106个/mL,以及去雄后第5天授粉为最佳参数;Southern杂交检测结果表明,T2阳性植株的2个株系检测到杂交信号,同时其幼根、叶片等组织经GUS表达活性的组织化学染色检测,呈现蓝色反应.[结论]利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合到小麦基因组中并稳定遗传至T2,且外源基因GUS能够得到表达. 相似文献
22.
以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明:在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1.2μg/μL的质粒,在电场强度和脉)中时间分别为10kV/cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2.6×10^4CFU/μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。 相似文献
23.
以2岁奶牛输卵管为材料,用胰酶消化法分离得到了牛输卵管上皮细胞。输卵管上皮细胞在DMEM/F12培养基中生长良好。用一代牛输卵管上皮细胞为靶细胞,对其进行了电穿孔转染,转染对象是分子大小为31085bp的以β-casein启动子为基础的含有人胶原蛋白cDNA基因和EGFP、Neor双标记基因的质粒。电穿孔试验发现,牛输卵管上皮细胞在低渗缓冲液中电转染可以获得阳性转染子,其中以90mOsm/kg为最佳。电压以800V为好,电压高和低都不利于电穿孔的成功。成功转染的细胞用800mg/L G418进行筛选,在10d后获得了较大的阳性细胞克隆簇。对获得的阳性细胞克隆簇进行扩大后,得到了较纯的阳性细胞克隆系,流式细胞仪检测其纯度为81.6%。在荧光显微镜下选择阳性细胞作为核移植供体细胞进行了转基因克隆试验,结果显示以转基因和非转基因细胞为核供体获得的重构胚融合率差异显著(51.9%比63.2%),获得的桑椹胚/囊胚率差异不显著(20.3%比25.5%)。对获得的具有绿色荧光的胚胎进行DNA分析,结果显示这些胚胎成功转入了外源基因,并且转入的外源基因结构完整。 相似文献
24.
本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法,将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因(myostatin)药物正负筛选(PNS)打靶载体pLoxp-1.4K-4.3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中,而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现,脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法,但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小;采用与载体基因型相同的细胞系,两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。 相似文献
25.
采用电转化法成功的将带有发光酶基因luxAB的质粒pTR102导入缺陷短波单胞菌L19菌株(Brevundimonas diminuta L19)中,考察了电击时间、电击场强、细胞生长时期等因素对转化效率的影响。测定了转化子 L19-luxAB菌株的遗传稳定性以及标记基因的介入对L19菌株降解有机磷农药能力的影响,研究了L19菌株在土壤中的定殖动态和降解马拉硫磷的能力。结果表明,转化子L19-luxAB具有发光活性和对卡那霉素的抗性,遗传稳定性强,在抗性平板上传代15次仍有很强的发光活性,并且标记菌株与出发菌株对有机磷农药的降解能力无显著差异。证明可以应用L19-luxAB进行菌株土壤定殖生态学研究。标记菌株在灭菌土壤和自然土壤中均能很好的存活,具有明显的降解马拉硫磷的能力。 相似文献
26.
27.
Fuminori Tanihara Maki Hirata Nhien T. Nguyen Quynh A. Le Takayuki Hirano Tatsuya Takemoto Michiko Nakai Dai‐ichiro Fuchimoto Takeshige Otoi 《Animal Science Journal》2019,90(1):55-61
Recently, we established the GEEP (“gene editing by electroporation of Cas9 protein”) method, in which the CRISPR/Cas9 system, consisting of a Cas9 protein and single guide RNA (sgRNA), is introduced into pig zygotes by electroporation and thus induces highly efficient targeted gene disruption. In this study, we examined the effects of sgRNA on the blastocyst formation of porcine embryos and evaluated their genome‐editing efficiency. To produce an animal model for diabetes, we targeted PDX‐1 (pancreas duodenum homeobox 1), a gene that is crucial for pancreas development during the fetal period and whose monoallelic disruption impairs insulin secretion. First, Cas9 protein with different sgRNAs that targeted distinct sites in the PDX‐1 exon 1 was introduced into in vitro‐fertilized zygotes by the GEEP method. Of the six sgRNAs tested, three sgRNAs (sgRNA1, 2, and 3) successfully modified PDX‐1 gene. The blastocyst formation rate of zygotes edited with sgRNA3 was significantly (p < 0.05) lower than that of control zygotes without the electroporation treatment. Our study indicates that the GEEP method can be successfully used to generate PDX‐1 mutant blastocysts, but the development and the efficiency of editing the genome of zygotes may be affected by the sgRNA used for CRISPR/Cas9 system. 相似文献
28.
电穿孔技术在EBV—LMP表达质粒转染人鼻咽癌细胞中的应用 总被引:5,自引:0,他引:5
目的:观察人鼻咽癌细胞用电穿孔技术进行体外基因转染所需的转染电击条件EBV-LMP基因的转染表达。方法:以人高分化鼻咽癌细胞株(ENE1)为对象,用电穿孔基因转染技术,观察不同电压及电容条件电击癌细胞对基存活率的影响;将重组EBV-LMP表达质粒转染CNE1细胞,以载体质粒转染及未经转染的CNE1细胞为对照。结果:CNE1癌细胞存活率与电容及电压值的大小成反比。CNE1细胞转染较合适条件是电压值6 相似文献
29.
探索CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对串联型黄色荧光蛋白(YFP)表达的调控作用,将含有串联型YFP、CMV启动子、柔嫩艾美耳球虫组蛋白4(Histone4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列的重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子,观察荧光情况.结果证明,CMV启动子不能驱动YFP在柔嫩艾美耳球虫中正常表达,而其自身基因的侧翼序列能够启动和调控串联型YFP在柔嫩艾美耳球虫中的正常表达. 相似文献
30.
枯草芽孢杆菌转换效率低一直制约着该菌基因改造技术的应用,本研究比较了化学法和高渗电转化法对枯草芽孢杆菌转化率的影响,发现高渗电转化法的转化效率较高.从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,构建成重组分泌型表达载体pWB980-Mapr,碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌DB104中得到表达.SDS-PAGE 分析,重组蛋白酶的分子量为 28 000.pWB980-Mapr在枯草芽孢杆菌中表达的酶活为1 563 U/ml. 相似文献