猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物，构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验，成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法，用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝，熔解曲线有单一峰，批内变异系数CV为0.067%～0.184%,批间变异系数为0.221%～0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平，感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高，在感染后14 d可达到高峰，平均mRNA拷贝数达18 000左右，可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好，精确度高，特异性强，为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。     

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞，筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果：消化法分离的细胞约1周长成单层，组织块贴壁法约2周长满单层，但活力更高；PRCs主要形态为长梭形和大理石样，呈现为2种形态细胞混合生长；差速消化法纯化细胞后，经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞；细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上，本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基，该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变，为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。     

“互联网+”时代下的茶叶企业财会管理研究

经济与科技的进步使互联网得到了迅猛的发展，并广泛的应用到各行各业中。传统茶叶企业财会管理在实际的工作中面临各种问题，所以，在大“互联网+”背景下，需要顺应时代的发展潮流加快茶叶企业财会管理改革工作。本文从“互联网+”时代茶叶企业财会管理创新的必要性出发，深入分析了茶叶企业财会管理发展现状，提出“互联网+”时代背景下提升茶叶企业财会管理的有效途径，旨在为茶叶企业实现现代化财会管理模式提供参考。     

鸡传染性贫血病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus, CIAV),本研究参照GenBank中CIAV的VP2基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测CIAV的CRISPR/Cas13a方法，并验证了该方法的特异性、敏感性和复合性。结果显示，该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性，特异性良好无交叉反应；灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合率。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h内可对CIAV进行快速的鉴别诊断，为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。     

鸭甲型肝炎病毒3型和鸭圆环病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）和鸭圆环病毒（DuCV）的双重荧光定量PCR方法，试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列，分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针，建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估，并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示：建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应，对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL，批内和批间变异系数均小于2%，从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份，与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明，建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好，可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。     

基于高光谱和集成学习的库尔勒香梨黑斑病潜育期诊断

黑斑病是危害库尔勒香梨的真菌病害之一。若在黑斑病症状显证之前实现早期诊断，对于防止病害蔓延、减少经济损失具有重要的意义。结合高光谱成像技术和Stacking集成学习算法，构建了香梨黑斑病早期快速诊断模型。获取了健康、潜育期、轻度发病和重度发病的黑斑病库尔勒香梨的高光谱图像，提取感兴趣区域内的平均光谱，经标准正态变量变换、一阶导数、二阶导数及组合预处理后，利用主成分分析进行数据降维。然后，以K最近邻法（KNN）、最小二乘支持向量机（LS-SVM）和随机森林（RF）算法为基学习器，以LS-SVM为元学习器，构建了黑斑病病害程度的Stacking集成学习预测模型。结果表明，随着病害程度加深，光谱反射率整体呈下降趋势，且存在显著性差异，为分类模型的建立提供了理论依据。所建模型对健康和不同病害程度黑斑病库尔勒香梨的总体判别准确率为98.28%，对潜育期香梨的判别准确率为100%。与利用单一分类器建模结果相比，总体判别准确率和潜育期香梨判别准确率分别上升5.18、23.08个百分点。结果证明，Stacking集成学习具有较强的特征学习能力，将其与高光谱成像技术结合，能实现库尔勒香梨黑斑病潜育期的识别。该结果为库尔勒香梨黑斑病的早期快速诊断和发病过程的实时监测提供了一种新的方法。     

鸭甲肝病毒1型和3型一步法双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及其初步应用

为建立一种快速鉴别不同基因型鸭甲肝病毒(DHAV)的检测方法，根据DHAV-1和DHAV-3特异性序列，分别设计合成鉴别检测引物，经一步法双重RT-PCR反应条件的优化，建立了鉴别DHAV-1和DHAV-3的一步法双重RT-PCR方法，并应用该方法对2016—2021年山东地区采集的58份临床病料样品进行病原学检测分析。结果显示：该方法能够分别扩增出DHAV-1的230 bp和DHAV-3的502 bp的特异性条带，而DTMUV、NDV、AIV-H9、FADV、DEV、GPV均无任何扩增条带。该方法最低可检测到0.62 ng DHAV-1 RNA和0.59 ng DHAV-3 RNA。该方法与病毒分离方法的符合率达100%。该方法检测58份临床病料样品，共检测出阳性样品27份，阳性率达46.55%,其中2016—2021年DHAV-1阳性率分别为33.33%,25.00%,22.22%,12.50%,11.11%,0.00%;DHAV-3阳性率分别为8.33%,16.67%,22.22%,37.50%,33.33%,37.50%。表明建立的DHAV-1和DHAV-3一步法双重RT-PC...