基于差异蛋白质组学解析紫色杆菌素抑制结肠癌细胞HT29的作用机制

【目的】对紫色杆菌素作用后的结肠癌细胞HT29进行差异蛋白质组学分析,探究其影响的代谢通路,揭示其抑制癌细胞生长的作用机制,为新型抗癌药物的开发提供一定的参考。【方法】以不同剂量的紫色杆菌素处理HT29 24、48、72 h,通过MTT试验以及透射电镜分析其对结肠癌细胞的有效抑制剂量及抑制情况。在此基础上,对提取的3个处理组的蛋白进行同位素标记,利用反相液相色谱(RP-LC)联用串联质谱(AB SCIEX Triple TOF5600)获得样品中的多肽及其相对丰度信息,通过数据库(NCBI.Human.protein database)搜索比对,鉴定差异表达蛋白。利用GO分析、KEGG信号通路分析,解析紫色杆菌素抑癌作用代谢途径。【结果】紫色杆菌素对HT29的抑制作用呈一定的时间、剂量依赖性。当紫色杆菌素对HT29的抑制率达50%时,仅为阳性药物5-Fu剂量的1/6,具有更明显的抑制效果。电镜下观察显示,随着紫色杆菌素剂量增大,细胞内部线粒体出现空泡结构,质膜出泡;当浓度达30 mg·L~(-1)时,细胞膜消失,染色质边集。通过差异蛋白质组学分析,共鉴定出4 258个蛋白,表达差异在2倍以上的蛋白共为757个。其中高剂量组处理差异蛋白数为492个,低剂量组处理的差异蛋白数为112个,阳性对照组差异蛋白数为336个。KEGG分析显示这些差异蛋白共参与50条信号通路。其中有10条信号通路具有显著性(P0.05),主要参与核糖体循环途径、三羧酸循环途径和RNA降解途径等。【结论】紫色杆菌素主要通过影响HT29细胞生命活动中的蛋白转录和翻译水平进而发挥抑制作用。     

内生解淀粉芽孢杆菌CC09在小麦根部定殖的电镜观察及防病效果

采用抗利福平标记菌株的平板菌落计数法,检测了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦根部的定殖能力及消长动态,发现菌株CC09在小麦根内、根表和根际均能定殖,接种后5 d定殖量分别稳定维持在2.7×105、2.0×105和5.5×105 cfu/g。透射电镜观察发现,菌株CC09能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖,且不影响根组织细胞结构。室内盆栽试验表明,用菌株CC09发酵液灌根处理小麦,对由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum侵染引起的麦苗赤霉病的防效高达90.7%,表明菌株CC09是潜在的防治小麦赤霉病的生防菌,具有良好的开发和应用价值。     

卵母细胞扫描电镜和透射电镜样本的制作

[目的]探讨卵母细胞扫描电镜和透射电镜的制作方法,为相关研究提供技术支持。[方法]以猪GV期和体外成熟MⅡ期卵母细胞（抽吸法采集）为研究对象。①扫描电镜样本制备：供试GV期和MⅡ期卵母细胞于PBS（pH值7．4）中清洗后,部分转入0．1％透明质酸酶中,38．5℃孵育15min,微吸管吹打去除卵丘细胞（CC）,即获得无卵丘细胞的卵母细胞,用以观察卵母细胞外透明带（ZP）结构;取去除卵丘细胞的部分卵母细胞,经PBS液洗后,再置于0．5％链霉蛋白酶中,在实体显微镜下观察,待透明带溶解时,小心地将卵母细胞转入PBS中,即获得了无透明带的卵母细胞,用以观察卵母细胞膜表面的微绒毛（Mv）。未去除卵丘细胞的卵母细胞、去除卵丘细胞的卵母细胞及去除透明带的卵母细胞分别经PBS洗2～4次后,于2．5％戊二醛中4℃固定6h,再经PBS清洗3次,每次30min;再于1％锇酸中固定1．5h,然后再经PBS清洗3次,每次30min;之后,用乙醇逐级（30％、50％、70％、90％、100％、100％）脱水,每级20min;样品脱水后,用乙酸异戊脂置换;置换后的样品直接移到样品台上,再放入临界点干燥仪干燥,粘台,IB-5离子溅射仪喷金,置于扫描电子显微镜下观察、拍照。②透射电镜样本制备：供试卵母细胞也经PBS清洗,戊二醛固定,琼脂包埋后锇酸固定,乙醇脱水,步骤基本同上,只是最后用环氧丙烷置换。脱水后的样品于Epon-812树脂和丙酮等体积混合液中渗透4h,再在纯Epon-812中渗透过夜;然后将样品包埋,放入聚合器中聚合（35℃,24h;45℃,24h;60℃,48h）;聚合后的样品在实体显微镜下修块,半薄切片定位,重新包埋,LKB—V超薄切片机切片;超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色,样品自然干燥后在透射电子显微镜下观察、拍照。[结果]电镜下观察到的细胞形态结构完好,超微结构清晰。扫描电镜下,GV期卵母细胞的卯丘细胞紧密包围在卯母细胞外,微绒毛呈致密状垂直于卵膜表面,透明带呈不规则的蜂窝状,有小梁突起。在体外成熟MⅡ期卵母细胞中,卵丘细胞变得松散,卵母细胞表面的微绒毛结构显得更光滑,透明带呈不规则的蜂窝样,但蜂窝状结构增多,且小梁突起更明显。透射电镜下,GV期卵母细胞的卵丘细胞在透明带周围紧密排布,并有大量突起伸人透明带中;卵母细胞微绒毛数量较多、相对较长,且也伸人透明带中;线粒体呈圆形,多为横嵴并清晰,成簇分布于皮质区;脂滴以两种不同形式存在于大部分细胞质内,一种呈均质状,另一种不均质且有透亮条纹,两种形式的脂滴常相邻存在,并以均质脂滴居多。脂滴外包有不连续的滑面内质网;高尔基体发达,由多层扁平囊泡及大小泡组成;在MⅡ期卵母细胞中,卵丘细胞间缝隙连接增大,出现了明显的卵周隙;与培养前卵母细胞相比,微绒毛相对较短、较粗,且从ZP内撤回;线粒体体积增大,仍成簇伴随着脂滴分布;脂滴仍以两种不同形式存在,但以不均质脂滴居多;不均质脂滴呈球状,且上透亮条纹增多,电子密度更高;皮质颗粒位于卵质膜下,呈单层排列。[结论]证实该方法适用于卵母细胞超微结构观察的制样,另外,此法也适用于休积小、数量少、游离细胞的电镜样本制备。     

棉花GhCCR4基因的瞬时表达研究

利用棉纤维发育调控基因瞬时表达体系,分析目的基因在棉花纤维发育过程中可能存在的功能。实验构建了由CaMV35S启动子驱动的pGUS-CCR4融合瞬时表达载体,使用基因枪轰击法转化棉花胚珠,确定了转化0DPA胚珠的最佳条件:轰击压力为1350psi,轰击距离为9cm,轰击次数为2次。GUS组织化学染色结果表明,GhCCR4基因在棉花纤维伸长期和次生壁增厚期持续表达。不同发育时期纤维长度测量结果发现,在8DPA时转GhCCR4基因纤维长度和对照相比没有明显差别,但在27DPA时纤维长度明显短于对照。纤维透射电镜切片观察发现,转GhCCR4基因的细胞次生壁与对照相比增厚达17%。     

介绍两个花生新品种

山东省平度市花生科研开发中心,从花32×白沙505的杂交后代中高世代中选育出花生新品种“誉宇1号”及“誉宇3号”,这两个品种分别于2006年元月、2007年3月通过审定。该中心虽转让申请权和命名权,依然独家繁殖育种家种子（原原种）和安排原种高倍繁育及高产示范,申报单位另行命名通过审定的品种。     

巴布亚企鹅(Pygoscelis papua)精子形态及超微结构观察

为探明巴布亚企鹅精子的形态结构及超微结构特征，试验对5只处于繁殖季节的雄性巴布亚企鹅采用无创的背部按摩法获得新鲜精液，经扫描电镜和透射电镜对精子形态与超微结构分别进行分析。结果表明：利用扫描电镜观察到的巴布亚企鹅精子属于典型的鞭毛精子，头部呈椭球形，长11.40～11.60μm;精子中段较短，长1.83～2.69μm;精子尾部细长，长47.50～59.74μm;精子超微结构显示，精子的头部长而窄，呈椭球形，在中段发现了自噬体，长0.61～0.81μm,呈新月形，精子的尾部细长、呈鞭毛状。同时观察到了9+2微管结构0.30～0.42μm与尾部中心轴平行排列。此研究从试验层面阐明了巴布亚企鹅精子的超微结构，对巴布亚企鹅授精机制的研究、繁殖和种质资源库建设提供了基础，为有效遏制巴布亚企鹅遗传多样性的降低、也为珍稀动物巴布亚企鹅异位保存提供技术支持。     

犬细小病毒新乡株的分离鉴定及其VP2 基因的序列分析

【目的】探究河南省新乡地区犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）的流行和遗传变异进化情况，为有效防控区域性 CPV 流行提供参考。【方法】对从新乡地区宠物医院收集的 23 份疑似患犬细小病毒病的病犬粪便样品和眼、鼻、口、肛拭子预处理后进行 PCR 检测。将 PCR 检测结果为阳性的样品采用浸泡、过滤除菌处理后接种于单层猫肾细胞 CRFK 进行病毒增殖培养，将分离的病毒置于透射电子显微镜下观察。参考 GenBank中已收录的国内外 CPV 不同亚型的毒株序列，经 PCR 分段扩增、测序后拼接获得病毒全长基因，利用分子生物学软件对病毒基因进行序列分析和氨基酸序列同源性分析。【结果】从送检的样品中成功分离出 1 株 CPV，命名为 XX-2022 株。该病毒株能使 CRFK 细胞产生明显病变，导致细胞出现变圆、拉网和脱落。通过透射电镜可观察到典型的病毒粒子，呈圆形或六边形，直径约 25 nm，无囊膜。通过 PCR 分段扩增拼接后获得的病毒全基因组序列全为长 4 588 bp，CPV 系统进化分析结果显示，XX-2022 株与 Canine/SH/1/2019（MN840830.1）株的亲缘关系较近。利用 MegAlign 软件对 XX-2022 株 VP2 基因推导的氨基酸序列进行分析，该毒株与 YANJI-5（MW715601）的 VP2 氨基酸序列在同一小分支，氨基酸同源性为 99.7%。根据 CPV 的基因分型原则，最终确定 XX-2022 株 CPV 属于 CPV-2a 型。【结论】从临床病料中成功分离出 1 株 CPV，经分析确定为 CPV-2a 型，研究结果可为新乡地区 CPV 的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据，为 CPV 的区域流行及有效防控提供参考，为新疫苗的研发提供地方种毒。     

虾血细胞虹彩病毒在青虾中的感染情况调查分析

本研究对浙江省湖州市德清县的青虾养殖塘进行虾血细胞虹彩病毒(SHIV)的监测工作。2020年7—10月分别在2个青虾养殖户中检出感染SHIV的青虾,2021年在对德清县6个乡镇共计12个监测点中发现,50%养殖户的青虾有感染SHIV的情况。对SHIV阳性的青虾肝胰腺进行组织病理学染色分析表明,肝胰腺组织中存在核固缩的现象,同时透射电镜可以观察到疑似SHIV病毒粒子的结构。本研究初步探究了SHIV在日本沼虾中的流行情况,为SHIV与青虾病害的相关性提供了研究基础。     

长牡蛎与海豆芽外套膜细胞超微结构的比较观察

以软体动物中贝壳成分为碳酸钙的长牡蛎（Crassostrea gigas）和腕足动物中贝壳成分为磷酸钙的鸭嘴海豆芽（Lingula anatina）为研究对象，借助组织学和透射电镜方法，分别对两个物种外套膜边缘区域和中央区域的细胞进行超微结构观察，发现长牡蛎和鸭嘴海豆芽外套膜中的细胞类型均包含柱状表皮细胞、电子稠密粒细胞和电子透明粒细胞，但是两个物种的柱状表皮细胞类型以及分泌细胞的内含物各不相同。长牡蛎柱状表皮细胞包括三类，主要分布在外套膜边缘区域的A型、主要分布在外套膜中央区域的B型以及很少存在的C型，细胞大小为7～15μm。海豆芽柱状表皮细胞则分为A’型，B’型和C’型，细胞大小为10～15μm。两个物种的分泌细胞都包含电子稠密粒细胞和电子透明粒细胞，海豆芽还包括一类含有板层小体的特殊分泌细胞。上述结果在一定程度上可以解释两者贝壳组成成分的差异，从而为研究腕足动物和软体动物贝壳的形成机制和矿化作用提供借鉴。