猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究

为了建立稳定的血管内皮细胞系,进而为研究猪瘟病毒致病机理提供理想的细胞模型,将脂质体转染的pCIneo-hTERT质粒导入原代猪脐静脉血管内皮细胞中,经G418抗性筛选,挑取阳性克隆并扩大培养。对转染后的细胞进行形态观察,研究其增殖及生长特征,并对其端粒酶活性进行了鉴定。结果表明,转染细胞单层贴壁生长,有接触抑制性,呈铺路石状;F-ⅧAg和CD34免疫荧光鉴定阳性,具有转染前细胞特征;转染后细胞培养代数增加,传至第10代和15代转染后细胞端粒酶活性检测为阳性。说明hTERT转染可以延长猪血管内皮细胞的寿命。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

对网络广告规范化管理的认识与探讨

分析了我国网络广告及其管理的现状,探讨了网络广告规范化的必要性与可能性,提出了网络广告规范化管理的应对措施。     

猪瘟流行野毒株E_2基因编码的gp55蛋白模拟分析

利用RT-PCR和PCR技术扩增出近期猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到载体上测定核苷酸序列,根据Alfort株和Brescia株、C-株确定起始氨基酸三联体的正确位置后推导出其氨基酸序列,结果表明近期流行的猪瘟毒株与疫苗毒株和强毒株之间存在一定差异;利用DNAstar软件分析E2基因编码的gp55蛋白的疏水性、抗原性和二级结构,并与猪瘟疫苗毒株(C-株)进行比较,结果表明,目前流行的猪瘟病毒与疫苗毒的gp55蛋白在抗原性、二级结构上存在一定的差异,而C末端疏水性差异不大。     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

陕西省犊牛细菌性腹泻病原分离鉴定及敏感中药的筛选和初步应用

采取陕西省部分地区细菌性犊牛腹泻病料104份，进行病原细菌的分离鉴定，结果表明，引起该地区犊牛腹泻的细菌性病原主要是致病性大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、多杀性巴氏杆菌等；大肠杆菌主要以02、086、0138为优势血清型。根据抗生素及中药对分离菌的药敏试验结果，筛选出敏感中药并组方研制出”肠菌清散剂”进行临床防治试验，总有效率为88．9％。     

TGF-β1诱导SUVEC向平滑肌样细胞转分化的初步研究

用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～10ng.mL-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ng.mL-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。     

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

平顶山市山丘区小流域沟道治理工程设计技术研究

平顶山市利用沟道治理工程技术试验研究成果 ,取得了较好的效果 ,为同类地区小流域沟道治理提供了可借鉴的经验。提出了干砌石坝、微型土坝、蓄水塘坝等治沟工程设计方法。