Construction and Identification of HSP70 Antisense RNA Expression Vector for Genetic Engineering Male Sterility in Plant

[Objective] In order to study the relation between the HSP70 gene and male sterility of plant further. [Methods] Anther specific expression promoter Osg6B of rice was coloned by PCR then connected with HStrlO antisense fragment to construct HSP70 antisense expression vector. The expression vector was identified by PCR experiment and enzyme digestion. [Result]The sequence of coloned Osg6B promoter had 97% homology to the published se-quence, and the cis-regulatory element in promoter area was integrated. HSIrlO antisense expression vector driven by the promoter Osg6B was confired by colony PCR and enzyme digestion. [Conclusion]The construction of expressio~a vector would lay solid foundation for utilization of genetic,engineering male sterility of plant.     

植物HSP70反义基因工程雄性不育表达载体的构建及鉴定

构建由水稻花药特异性启动子Osg6B驱动的植物HSP70反义表达载体,为进一步通过基因工程创制植物雄性不育奠定基础。     

小麦16.9 kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用,根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段,即TaHSP16.9-1(GenBank登录号为EU649679).TaHSP16.9-1全长770 bp,5′非翻译区81 bp,3′非翻译区233 bp,开放阅读框编码151个氨基酸.序列分析结果表明,此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源,相似性介于78.3%～96.7%之间.定量RT-PCR表达谱分析显示,TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达,其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导.     

牙鲆变态中两种HSP90基因的不同表达及其与甲状腺激素的关系

热休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)是细胞内主要的伴侣蛋白,在激素信号转导、细胞分化、细胞增殖与凋亡、形态发生与进化、变态发育及应激防御等多重调节路径中发挥关键作用。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了牙鲆两种HSP90基因在仔鱼发育和在成年组织中的表达变化。结果表明,HSP90α在成鱼骨骼肌、肠和胃中有较高的表达,而HSP90β在成鱼脑、脾脏和肾脏中有较高的表达。HSP90αmRNA水平在仔鱼变态期间迅速增加,至变态高峰G期达到最高水平;相反,HSP90β转录在仔鱼整个变态期间变化不是特别明显。鉴于甲状腺激素(thyroid hormone,TH)在牙鲆变态中的重要作用,还运用外源的TH及硫脲(thiourea,TU)处理牙鲆仔鱼来确定TH对HSP90基因转录的调节。与未处理组相比,HSP90α转录在TH处理8d和13d的仔鱼中显著增加,而在TU处理仔鱼中明显减少;但HSP90βmRNA水平不受药物处理影响。从上述结果分析,牙鲆中HSP90α的转录很可能被甲状腺激素上调,而且其在牙鲆的变态发育中发挥了重要作用。     

克氏原螯虾对高温应激的生理学响应

本实验旨在研究高温对克氏原螯虾(Procambarus clarkia)血液生化指标、抗氧化能力以及热休克蛋白70基因表达的影响。实验分别采用30℃和35℃水温进行高温应激试验,应激前(0 h)和在应激后3、6、12、24和48 h分别采集样本,测定血淋巴液中LDH、GLU、TCHO、TP和TG含量,测定肝胰腺T-AOC、CAT、MDA以及HSP70基因的表达变化。结果显示:在高温应激的初级阶段(6 h),克氏原螯虾血淋巴中的TCHO和LD含量急剧上升,而GLU含量持续上升到24 h;TG含量在应激的初级阶段变化不明显,但在6 h后急速上升,在12 h达到最高后开始回落;TP的含量在初级阶段出现下降,然后在12 h恢复至应激前水平。肝胰腺中的MDA含量在应激后持续上升,在24 h后达到最高值,随后下降至应激前水平;T-AOC在应激后3 h上升至最高水平,随后降低;CAT的含量分别在应激后6 h和12 h上升至最高值然后回落。HSP70基因在应激前未检测到有表达,高温应激后3 h即可检测到少量表达,35℃组在6 h出现大量表达,并持续到12 h,随后24 h降低至无法检出;而30℃组在应激6 h后降低至无法检出。结果表明,30℃和35℃高温能引起克氏原螯虾机体产生应激反应,并对机体的生理机能产生影响。     

KK-42对凡纳滨对虾热激蛋白基因表达的诱导作用

为探讨咪唑类物质KK-42可能的作用机制,首次克隆了热激蛋白90(HSP90)部分mRNA序列,研究了HSP90以及HSP70基因的时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。结果显示, HSP90和HSP70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSP mRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显著诱导肝胰腺HSP的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分别比相应的对照组升高了243.4%、141.3%、410.5%和121.6%、505.5%、481.7%。结果表明,KK-42处理可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺HSP90和HSP70基因的转录水平。     

鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用

为探讨池塘种植鱼腥草对无乳链球菌引起吉富罗非鱼肝脏损伤的修复作用,在养殖池塘中分别种植0%(对照组)、5%、10%和15%池塘面积的鱼腥草,养殖90 d后进行无乳链球菌人工感染,分别在感染后0、24、48和72 h采集吉富罗非鱼肝脏,进行肝脏生化、抗氧化性能、组织病理和热休克蛋白70基因(HSP 70)表达研究。结果显示,感染后48和72 h对照组肝脏谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性最高,种植鱼腥草各组吉富罗非鱼肝脏ALT活性在感染前后均无显著性变化,感染后72 h,10%组吉富罗非鱼肝脏AST活性已恢复到感染前水平。抗氧化指标显示,种植鱼腥草能减缓链球菌感染引起吉富罗非鱼肝脏总抗氧化能力(T-AOC)下降,显著提高肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和一氧化氮合酶(NOS)等抗氧化酶的活性,增加自由基清除能力,减少脂质过氧化丙二醛(MDA)的产生。组织病理学观察显示,对照组吉富罗非鱼感染后48 h肝窦明显淤血,肝索排列紊乱,肝细胞脂肪变性,而各种植鱼腥草组吉富罗非鱼在感染后仅表现为肝细胞明显嗜酸,肝窦轻度扩张。定量PCR结果显示,每组吉富罗非鱼肝脏HSP 70表达量在感染后都显著升高,感染后各时间点对照组吉富罗非鱼肝脏的HSP 70表达量均显著高于鱼腥草种植组。研究表明,种植鱼腥草能显著改善链球菌感染所造成的吉富罗非鱼肝脏AST和ALT上升,提高抗氧化应激能力,减轻链球菌感染引起的病理损伤;吉富罗非鱼通过肝脏HSP 70高表达促进受损蛋白质的早期修复与降解,种植鱼腥草具有抗炎作用和提高鱼体抵御病原菌的能力。     

大菱鲆热休克蛋白90基因cDNA的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到HSP90,采用基因克隆方法获得含有1个97bp的5’UTR、2190bp的开放阅读框和501bp的3’UTR的全长cDNA序列。整个开放阅读框编码729个氨基酸,包含HSP90家族5个保守信号区。与其他物种已知序列同源比对的结果显示,此编码氨基酸更接近于热休克蛋白90β亚型(HSP90β),与牙鲆HSP90β的同源性高达96.6%。RT-PCR分析表明,在胚胎发育初期就能检测到HSP90,其表达量伴随着胚胎发育,先增加后减少,在尾芽期达到最高。HSP90在健康大菱鲆各供试组织中均有表达。经鳗弧菌感染处理后,在胚胎细胞中也有HSP90的强烈表达。结果显示,大菱鲆HSP90cDNA序列为HSP90β,是一种组成型表达的基因,其在维持正常生理机能、胚胎发育和应激中发挥重要的作用。     

哺乳动物热休克蛋白70表达的基因调控与生物学功能

热休克蛋白70(HSP70)是热休克蛋白家族中的重要成员,作为一种细胞内源性保护蛋白,当机体或细胞遭受应激时,它可以通过一定的表达调控机制进行显著增量表达,并在一定范围内发挥其特有的生物学功能来抵御或减缓应激对细胞的损伤。     

HSP27和Annexin A2蛋白对PRRSV感染的影响

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）侵染Marc145过程中HSP27和Annexin A2蛋白可参与病毒粒子的组装过程,且HSP27可起到抑制侵染早期细胞凋亡,增加病毒复制时间的作用。本研究分别构建HSP27和Annexin A2下调的Marc145细胞系,经PRRSV感染后发现,与空白对照相比,两者子代病毒TCID50值有明显下降。这一结果为研究PRRSV侵染过程及HSP27和Annexin A2调控机制奠定了基础,也为疫苗的研制提供了新的思路。