猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。     

鸭舍中气载内毒素的测定

对五个鸭舍环境中气栽内毒素浓度与气载需氧革兰氏阴性菌浓度进行了测定，并对二者之间的数量关系进行了统计分析，同时对需氧革兰氏阴性菌的成分进行了研究。在测量的鸭舍中革兰氏阴性菌菌群占优势的是肠杆菌，其中大肠杆菌最为常见。气载内毒素与气载需氧革兰氏阴性活菌含量和气载需氧活菌总数在数值上存在弱的正相关，此结果表明不能通过测定气载需氧革兰氏阴性细菌或需氧细菌总数来估计气载内毒素的含量。舍内气载内毒素的含量介于0．19-20．081063EU／m^3之间；气载需氧革兰氏阴性活茼的含量介于1．69～90．3710^3CFU／m^3之间；气载需氧活菌含量介于1．01～55．7210^4CFU／m^3之间。     

魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列，设计合成了一对特异性引物，通过PCR的方法，扩增出了大小为470bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段，制备了α毒素基因探针，该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应，与其它多种细菌DNA不发生反应；该探针在1：1000的工作浓度下，能检出1-5pg／uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交（Dot-Blotting）检测，结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性，可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌参考株抗血清的制备及野毒株血清型鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全部12个血清型的国际参考菌株接种于培养基大量培养。回收菌体、甲醛灭活后，加入蜂胶佐剂制成疫苗。分别免疫健康的试验用白兔。获得针对该菌单一血清型的抗血清。虽然不同血清型间有一定的交叉反应，但对同源菌株的菌体抗原的凝集效价最高。分别可达6～8个log2。用该套血清对2003年从山东省各地分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌野毒株11株进行了血清型鉴定。分别为3型（2株）、4型（1株）、5型（4株）和7型（4株）。     

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。     

地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用

利用PCR反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650 bp的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102 个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。     

禽肉中氯霉素药残的快速检测

近年来 ,在对外出口畜禽食用产品时 ,对氯霉素残留的检测成为必不可少的检测指标。国外一般要求畜禽食用产品中氯霉素不得超过 1ｎｇ/ｍｌ,这对检测手段的灵敏度提出了很高的要求。目前我国国内常用的检测氯霉素药残的方法是使用液相法或气相色谱法来对其进行检测 ,但这种检测方法对样品的处理比较复杂 ,对实验操作技术要求很高 ,不利于在基层生产单位推广应用。本实验根据酶联免疫吸附 (ＥＬＩＳＡ)借助于氯霉素残留快速检测试剂盒对鸡肉组织残留的氯霉素进行检测 ,处理简单 ,操作步骤简便 ,可以快速有效地测定出肉品中的氯霉素残留量 ,其…     

鸭舍中气载内毒素的测定

对五个鸭舍环境中气载内毒素浓度与气载需氧革兰氏阴性菌浓度进行了测定,并对二者之间的数量关系进行了统计分析,同时对需氧革兰氏阴性菌的成分进行了研究。在测量的鸭舍中革兰氏阴性菌菌群占优势的是肠杆菌,其中大肠杆菌最为常见。气载内毒素与气载需氧革兰氏阴性活菌含量和气载需氧活菌总数在数值上存在弱的正相关,此结果表明不能通过测定气载需氧革兰氏阴性细菌或需氧细菌总数来估计气载内毒素的含量。舍内气载内毒素的含量介于0.19~20.08103EU/m3之间;气载需氧革兰氏阴性活菌的含量介于1.69~90.37103CFU/m3之间;气载需氧活菌含量介于1.01~55.72104CFU/m3之间。     

尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL~4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL~5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。