野油菜黄单胞菌XC3813报告质粒的构建及其表达的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是引起十字花科作物发生黑腐病的病原菌,在以前的研究中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含三个基因XC3813-3815的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。将XC3813的启动子与报告基因gusA融合,构建XC3813的报告质粒pRE3813gus。通过分析报告质粒在致病相关基因rpfC、opsX和clp的突变体背景下的表达,发现rpfC和opsX的失活可使报告基因的表达分别降低42．8％和55．7％。这表明XC3813的表达可能直接或间接受rpfC和opsX基因的影响。     

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ED途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ED途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77．6％。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ED途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。     

十字花科黑腐病菌hrpG基因原核表达

在十字花科黑腐病菌（Xcc）中,hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用,而hrpG对整个hrp基因簇起调控作用。HrpG为OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白,含有两个结构域,分别是N端Response_reg和C端Trans reg_C。本研究利用表达载体pQE-30Xa,成功构建了HrpG的表达重组子,在E.coliM15[pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为20℃,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。hrpG基因在宿主细胞E.coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有可溶性HrpG蛋白获得成功表达的报导,本研究中获得HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达,将为in vitro研究HrpG的生理活性,特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

水稻细菌性条斑病菌中一个调控致病性的DNA结合蛋白负调控胞外酶活性

 原核革兰氏阴性菌稻黄单胞菌稻生致病变种 (又称水稻细菌性条斑病菌,Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是引起水稻细菌性条斑病的病原物,该病是水稻粮食生产中的严重病害之一。我们的前期工作对广西农科院分离到的Xoc菌株GX01进行基因组序列分析,发现一个编号为gx01_0566的基因可能编码一个Fis家族的DNA结合蛋白。本工作采用自杀质粒pK18mobsacB介导的方法来构建该基因的缺失突变体,并对突变体进行反式互补。表型分析发现,gx01_0566基因的突变体在寄主水稻日本晴上的致病力显著下降,但其胞外多糖产量与野生型基本一致,胞外酶尤其是胞外纤维素酶活性却大幅度提高。为进一步研究gx01_0566基因在Xoc中调控胞外纤维素酶的机理,我们对该基因的产物进行过量表达和纯化,并通过凝胶阻滞实验和实时定量PCR实验分析,发现gx01_0566编码产物能够结合在一些编码纤维素酶的基因的启动子上,负调控这些纤维素酶基因的表达。     

基因工程多媒体教学初探

基因工程是生物技术和生物工程专业的主干课程，其课程教学必须适应当今教育要求，以培养学生综合素质．促进学生跟上学科的发展及提高学生实践能力。为此，开展了运用现代化多媒体为辅助手段的教学改革，文章就多媒体教学过程中几个问题进行了探讨。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

野油菜黄单胞菌XC3813-3815基因启动子的定位分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。本工作通过PCR合成包含相应ORF及其上游不同长度的DNA片段,并克隆于不带启动子的质粒载体pLAFR6后,将所获的重组质粒互补相应的突变体。通过这一功能互补的方法,确定了这三个基因在其ORF上游约50bp内分别拥有自身的启动子。     

水稻黄单胞菌水稻致病变种rpfC缺失突变体在感病和抗病水稻品种中的繁殖和扩展

水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)中国菌株13 751和水稻品种广桂110和IR26的相互作用分别为亲和和不亲和相互作用.13751的rpfC基因缺失突变株SL3751在电镜下的形态和野生型没有显著差别,均为短杆状,大小为(0.5～0.8)×(1.0～2.0) μm.用108 cfu/mL或1010 cfu/mL的SL3751剪叶接种苗期和分蘖盛期的广桂110,接种后5 d内SL3751在广桂110中的生长繁殖和野生型相似,但接种5 d后SL3751在其中的活菌数均稳定在106-7 cfu/叶,最终SL3751的活菌数比13751的低100倍左右.在抗病品种IR26上,接种后5 dSL3751也增殖到106-7cfu/叶,之后也保持在这一水平,最终SL3751的活菌数比野生型的低10倍左右.另外,SL3751在被接种到广桂110和IR26后,它被主要局限在剪叶接种切口下3 cm范围内.野生型接种在广桂110上,接种后3 d就迅速沿叶脉往下扩展,野生型13751在抗病品种IR26中的扩展速度显著慢于其在广桂110中的扩展速度.所有这些都进一步证实rpfC基因在13751在致病过程中起主要作用.     

一种潜在的生物防治水稻细菌性病害的方法(英文)

通过Ｔｎ５诱变、缺失分析和标记置换构建了一个缺失了ｒｐｆＣ基因上游约０．８ｋｂ序列的水稻黄单胞菌水稻变种突变株，该突变株被命名为ＳＬ３７５１，在剪叶接种植株试验中，ＳＬ３７５１对水稻广桂１１０具有极弱的毒性，而在浸种和喷雾接种试验中它不致病．在剪叶时，该突变株能在广桂１１０叶片中繁殖到每叶含１０７菌落，这比野生型低两个数量级，ＳＬ３７５１能侵染水稻种子并在随后长成的植株中定殖．用突变株浸种处理广桂１１０种子，在温室生长植株的分蘖和抽穗期分别剪叶接种野生型菌株，接种１４ｄ后，处理植株的病斑长度分别对比对照植株的病斑长３９．０％和１８．６％．在温室条件下，ＳＬ３７５１预处理广桂１１０种子能使水稻细菌性条斑病的病情指数降低５．３，预效５４．６％．１９９６年晚造，经ＳＬ３７５１浸种处理过的小苗移栽到大田中，在植株分蘖早期喷雾接种野生型菌株后２０ｄ，处理植株的病情指数为９．１５，比对照植株低３．６８．突变株浸种处理对白叶枯病的防效为２８．７％．这表明本研究将是一种新的具有发展潜力的生物防治水稻细菌性病害方法