甘蔗类甜蛋白基因ScTLP2和ScTLP3的生物信息学分析及表达

类甜蛋白(thaumatin-like proteins,TLPs)是一类与作物抵抗真菌病害紧密相关的病程相关蛋白。本研究从课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库中筛选获得两个甘蔗类甜蛋白基因(ScTLP2和ScTLP3),利用生物学软件对ScTLP2和ScTLP3基因进行序列特征、结构功能及聚类分析,采用qRT-PCR技术,检测ScTLP2和ScTLP3基因在不同甘蔗组织和黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)胁迫下的表达情况。生物信息学分析显示,ScTLP2基因全长1835 bp,包含1个969 bp的完整开放读码框,编码322个氨基酸;ScTLP3基因全长1259 bp,包含1个765 bp的完整开放读码框,编码254个氨基酸。ScTLP2和ScTLP3编码蛋白均含有THN家族的保守结构域和糖苷水解酶家族的64结构域(GH64-TLP-SF),两者分别隶属于TLPs家族中的Ⅵ类和Ⅰ类。q RT-PCR结果表明,ScTLP2和ScTLP3基因在甘蔗中均为组成型表达,其中ScTLP2基因在蔗叶中的表达量最高,是蔗皮的11.2倍,而ScTLP3基因在蔗芽中的表达量最高,是蔗皮的45.3倍。受黑穗病菌侵染后,ScTLP2基因在甘蔗抗黑穗病品种‘崖城05-179’中上调表达,而在感黑穗病品种‘ROC22’中无明显变化;相反的,Sc TLP3基因表达量在‘崖城05-179’中无明显变化,在‘ROC22’中上调表达。以上结果为深入研究甘蔗ScTLP家族基因的结构和功能积累了基础资料。     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶基因(ScAPX)的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要酶类.本研究对针刺接种黑粉菌(Sporisorium scitamineum)后的抗、感基因型甘蔗(Saccharum officinarum)进行APX活性测定.结果表明,甘蔗接种黑穗病菌48h内,抗病品种(崖城05-179) APX活性显著高于感病品种(柳城03-182) (P＜0.05).借助电子克隆技术,结合RT-PCR方法,从甘蔗中分离到一个APX基因,并命名为ScAPX(GenBank登录号:KJ7565501).生物信息学分析显示,ScAPX基因全长l 171bp,包含一个1 038 bp的完整开放阅读框,编码345个氨基酸.ScAPX编码的蛋白不含信号肽,推测其为非分泌蛋白,定位于线粒体基质和叶绿体基质中的概率分别为91.1％和88.7％.实时荧光定量PCR检测结果显示,ScAPX在甘蔗根、芽、叶、蔗皮和蔗髓中均有表达,为组成型表达基因,表达量在蔗皮中最高,叶中最低,前者是后者的19.7倍;在外源因子处理后0～48 h,ScAPX基因的表达受水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、氯化钠(sodium chloride,NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)诱导,SA、MeJA和H2O2处理后的ScAPX 转录本积累量峰值较外源激素(ABA)和环境(NaCl和PEG)胁迫早.前者的ScAPX转录本变化呈现出胁迫初期积累量增加,达到峰值后又逐步下降的特点;在同样的测试时间(处理后24 h)内,ABA、NaCl和PEG处理后ScAPX转录本在达到峰值后未见下降.虽然在外源胁迫下,ScAPX表达量变化存在明显差异,但其表达均表现出正响应上述外源因子对甘蔗的胁迫.本研究为后续深入鉴定该基因的功能与进一步应用提供基础资料.     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenasesuperfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为?0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLAT_LH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP_002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。     

甘蔗过氧化物酶基因ScPOD02的克隆与功能鉴定

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物各种器官及其不同发育阶段,在植物生长发育及应对逆境胁迫中起重要作用。本研究基于前期转录组数据,从黑穗病菌侵染2 d的甘蔗抗黑穗病品种崖城05-179中分离到ScPOD02基因的cDNA(GenBank登录号为KU593507)及基因组DNA(GenBank登录号为KU593508)序列。其cDNA全长为1434 bp,ORF区为1047 bp,编码348个氨基酸,而基因组DNA全长为1558 bp,含2个外显子和1个内含子。系统发育树显示,ScPOD02与水稻Os Prx11(GenBank登录号为gi|55700889)属于同一个进化分支,推测ScPOD02属于酸性胞外分泌/细胞壁类型的I.1型过氧化物酶家族。将该基因克隆到原核表达载体p ET 32a上,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导成功获得了大小约60 k D的融合蛋白,且该重组菌在聚乙二醇胁迫下的长势较对照快,表明其耐受干旱胁迫的能力更强。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,除ROC22和YZ03-103外,ScPOD02基因在甘蔗抗病品种(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)中受黑穗病菌诱导上调表达,但在中感(GT02-467和FN39)和感病(FN40)品种中的基因表达量基本维持不变或略有降低;此外,ScPOD02积极应答水杨酸、脱落酸、聚乙二醇及氯化钠的胁迫。通过农杆菌介导法在本氏烟叶片上瞬时表达ScPOD02,结果显示出较深的DAB染色,且过表达后本氏烟中的目标基因(ScPOD02)及过敏性反应(HR)标记基因(Nt HSR201和Nt HSR203)和乙烯合成依赖基因(Nt EFE26和Nt Accdeaminase)均上调表达。以上研究结果显示,ScPOD02具有参与甘蔗免疫应答及抗旱和抗盐害的潜在功能。     

硅对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌效果研究

由鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的黑穗病是甘蔗（Saccharum spp.）生产上最重要的真菌病害。硅是植物生长过程中的有益矿质元素,能够提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。目前,关于外源硅对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌作用尚未见报道。本研究以硅酸钠（sodium silicate, Na₂SiO₃）和硅酸钾（potassium silicate, K₂SiO₃）处理甘蔗黑穗病菌,观察黑穗病菌的孢子萌发、菌落直径和菌丝生长情况,评价不同硅剂和pH对甘蔗黑穗病菌的体外抑菌效果。结果显示,0.5~20.0 mmol/L Na₂SiO₃和K₂SiO₃均完全抑制甘蔗黑穗病菌的孢子萌发,但1.0 mmol/L Na₂SiO₃促进甘蔗黑穗病菌菌落和菌丝的生长,10.0、20.0 mmol/L Na₂SiO₃和K₂SiO₃则显著抑制菌落和菌丝的生长,表明Na₂SiO₃和K₂SiO₃均会影响甘蔗黑穗病菌的生长,高浓度Na₂SiO₃和K₂SiO₃的抑菌效果明显。在不同pH条件下,低pH（5.87~10.86）处理下的甘蔗黑穗病菌孢子有萌发,但其萌发率随着pH的增大逐渐降低,高pH（≥10.96）完全抑制孢子萌发,此外,pH为9.40和11.57对菌落直径的抑制效果明显。调整pH为6.0的低浓度Na₂SiO₃（0~5.0 mmol/L）和K₂SiO₃（0~3.5 mmol/L）对孢子萌发影响小,但pH为6.0的高浓度Na₂SiO₃（7.0~20.0 mmol/L）和K₂SiO₃（5.0~20.0 mmol/L）显著抑制孢子萌发,表明相同pH水平下的K₂SiO₃比Na₂SiO₃及其对应pH处理对甘蔗黑穗病菌孢子萌发的抑制作用更为明显。研究结果为外源硅在甘蔗抗黑穗病的药效试验和防治机理研究提供参考。     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。