柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

甜橙超低温保存后培养基的筛选

为使甜橙嫩芽组织通过超低温保存处理后能顺利分化再生，本文对甜橙嫩芽后培养基进行了筛选。通过柑桔组织常用培养基DM,MS和MT的比较以及在基础培养基中添加不同浓度激素组合,观察了不同激素组合水平对经过超低温前处理甜橙嫩芽的组织培养效果。研究结果表明, 经过前处理的甜橙嫩芽在添加PPM 0.5mgIAA 0.25mgBA 50g蔗糖/L的BM培养基上的成活率可达76.7%，褐化率16.7%，且生长较快，长势良好，推荐为甜橙超低温保存后恢复生长的培养基。     

应用2D-DIGE技术分析柑橘衰退病毒诱导的甜橙差异表达蛋白

【目的】为了研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)诱导甜橙差异表达蛋白的分离和鉴定,【方法】以接种了CTV的甜橙植株为实验组,健康植株为对照组,利用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术分析CTV诱导的甜橙差异表达蛋白。【结果】以t检验P<0.05和相对表达量≥1.5的水平作为判别标准,获得了91个CTV诱导的差异表达蛋白点,在实验组中含量高于对照组的蛋白56个,含量低于对照组的蛋白35个。通过MALDI-TOF质谱分析成功鉴定从中选择的37个蛋白点,其中19个蛋白功能明确,16个为预测或假定具有某种蛋白功能,包括与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶,与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白,分子伴侣热激蛋白,折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶,以及与光合代谢相关的蛋白等。【结论】CTV的侵染影响到甜橙各种复杂的生物学过程。     

柑桔溃疡病菌致病性研究初探

从四川、湖北两省收集的柑桔病样分离出2个溃疡病菌株,经生物学和PCR鉴定后,分别针刺接种于纽荷尔脐橙、福本脐橙、卡拉卡拉脐橙和春见桔橙等4个柑桔品种;接种2 d后调查发病情况,使用DPS软件8.01的Duncan新复极差法进行分析.结果表明,接种后4 d是最佳观察时期,4个柑桔品种分别接种上述菌株后发病率无明显差异,老叶和成叶的发病率要高于嫩叶的发病率,叶片不同部位之间的发病率也基本相当,桔橙的抗病性要高于脐橙的抗病性.     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

柑橘茎尖嫁接脱毒技术研究进展

柑橘茎尖嫁接技术是脱除其病毒和类病毒获得无病毒植株最常用且最有效的技术。围绕茎尖嫁接技术成活率和脱毒率的研究进行了阐述,以期为柑橘无病毒苗木的生产提供参考。     

柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及变异的影响

为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）不同基因型的抑制效果,将T36、T30、VT和T3等基因型CTV的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱檬’和‘强徳勒柚’,运用RT-qPCR技术检测被接种植株中CTV复制水平的差异。结果表明,‘墨西哥莱檬’最适于CTV各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中VT、T3和T36基因型的复制水平最低。4种柑橘品种对T36基因型CTV都有明显的抑制作用。通过对CTV的CP基因进行分析发现,VT基因型CTV在‘赛蒙斯’甜橙中发生了较大变异。     

病毒诱导的基因沉默（VIGS）研究进展

病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）是一种RNA 介导的植物抗病毒机制,近年来已被用作研究植物基因功能的反向遗传学手段。与转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比,VIGS 技术研究周期短,不需要遗传转化,具有低成本、高通量等优势。因此,VIGS已被广泛应用于植物抗病抗逆、生长发育以及代谢调控等生理途径相关基因的功能鉴定。综述了VIGS 的机制、技术发展、沉默效率的影响因素及其在植物基因功能鉴定中的应用,并对VIGS 在植物性状改良及植物保护方面的应用前景进行了展望。