利用离果山羊草3C染色体诱导簇毛麦2V染色体结构变异

【目的】簇毛麦是普通小麦的一个近缘物种,它具有许多抗病基因,在小麦育种中起重要作用。抗白粉病基因Pm21已被南京农业大学细胞遗传所成功地转移到小麦背景中,并被广泛地用于小麦育种实践。为了进一步转移和利用定位于簇毛麦2V染色体上的有用基因,如抗眼斑病基因、抗条锈基因和护颖颖脊刚毛基因,为小麦育种创造新种质。【方法】通过普通小麦农林26-离果山羊草3C二体异附加系与小麦-簇毛麦2V（2D）二体代换系杂交,综合运用染色体C-分带、基因组原位杂交、染色体构型分析和分子标记分析。【结果】从杂种F２和F３中鉴定出涉及簇毛麦2V结构变异的异染色体系7份,包括纯合缺失系1份（Del 2VS•2VL-）,易位系4份,其中纯合易位2份（初步推断为T3DS•2VL,T2VS•7DL）、小片段易位1份（T6BS•6BL-2VS）和中间插入易位1份（T2VS•2VL-W-2VL）,等臂染色体1份（2VS•2VS）和单端体1份（Mt2VS）。利用可分别追踪2VS 和2VL的分子标记Xwmc25-120和NAU/STSBCD135-1进行PCR分析,进一步证明这7份异染色体系中涉及簇毛麦2V染色体片段。【结论】涉及2V短臂的单端体Mt2VS,等臂染色体2VS•2VS和易位系T2VS•7DL在护颖颖脊上有簇状分布的刚毛,而涉及2V长臂的易位系T3DS•2VL无刚毛,进一步证实簇毛麦护颖颖脊刚毛基因位于2VS。离果山羊草3C染色体可有效诱发簇毛麦2V染色体结构变异。     

簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用

为开发簇毛麦6V染色体短臂特异的分子标记,并利用这些标记对缺失系进行鉴定,选用11个RGA和17对STS引物进行多态性分析,其中1个RGA引物和1对STS引物在对普通小麦扬麦5号、簇毛麦及普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系进行多态性分析时,分别检测到一条约1 000 bp和约800 bp的多态性片段,将这两个标记转化为稳定的特异性分子标记,分别命名为CINAU17-1086和CINAU18-₇₂₃。运用这两对引物对一系列材料进行扩增,只有含6V染色体短臂的材料才能扩增出相应的特异条带,表明这两个标记均位于簇毛麦6VS上。进一步利用簇毛麦6VS缺失添加系、易位系将CINAU17-₁₀₈₆标记定位在簇毛麦6VS FL0.58与FL0.70之间,将CINAU18-₇₂₃标记定位在簇毛麦6VS FL0.45与着丝粒之间。利用这两个特异标记对通过花粉辐射获得的部分簇毛麦6VS结构变异材料进行PCR鉴定,其结果与细胞学鉴定结果一致。CINAU17-₁₀₈₆和CINAU18-₇₂₃标记可用来快速检测和追踪导入普通小麦背景中的簇毛麦6VS染色体片段,并对缺失系的断点进行了初步界定。     

小麦类甜蛋白基因的转化及转基因植株的抗病性分析

目前已克隆出许多类甜蛋白基因并成功转化马铃薯、水稻和小麦等植物,均可引起植株抗病性的提高。在以往的研究中我们从小麦中克隆了一个类甜蛋白基因(Ta-Tlp),该基因在高抗白粉病的小麦6VS/6AL易位系中能够高水平表达,推测它与白粉病抗性密切相关。为进一步研究该基因的功能,本研究构建了包含在ubi强启动子控制下的Ta-Tlp基因的表达载体pAHC-TlP,用基因枪将其导入小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织,在含除草剂的选择培养基上经两轮筛选和分化,获得再生抗性植株。对T0、T1和T2代植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,结果表明Ta-Tlp基因已整合进受体基因组并且能够表达。对T0代及其衍生的T1代(来自6个T0代阳性株系的183个单株)和T2代(来自6个T0代阳性株系的241个单株)转化植株进行白粉病抗性鉴定,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,其白粉病抗性有一定提高。对T2代阳性转化植株进行赤霉病抗性鉴定表明,其抗性与受体对照相比无显著差异。     

利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及其抗病机制的初步研究

利用大麦基因芯片筛选差异表达基因并结合RT-PCR分析技术，对簇毛麦的抗白粉病机制进行了初步研究。基因芯片杂交试验获得了抗病簇毛麦非诱导叶片、抗病簇毛麦和感病突变体经白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）诱导叶片的基因表达谱。抗病簇毛麦经白粉菌诱导前后的表达谱及RT-PCR分析结果表明，抗病簇毛麦中乙烯和水杨酸信号途径的部分基因被白粉菌诱导增强表达，参与了白粉病的抗性过程。另外，通过比较诱导的抗病簇毛麦与诱导的簇毛麦感病突变体的表达谱并结合RT-PCR分析，发现感病突变体中乙烯和茉莉酸途径的部分基因被白粉菌诱导表达参与防卫反应，未观察到水杨酸信号途径参与防卫反应的证据。同时对抗、感簇毛麦经白粉菌诱导不同时间的叶片进行了内源水杨酸含量的测定，结果表明抗病簇毛麦经白粉菌诱导后水杨酸含量明显上升，而感病突变体中水杨酸含量始终处于较低水平。由于乙烯信号途径是抗、感簇毛麦中共同的信号途径，而水杨酸途径只在抗病簇毛麦中参与抗病反应，所以在簇毛麦的抗病过程中，水杨酸途径是一种最有效的信号传导途径。还筛选出一批与簇毛麦抗白粉病相关的基因，包括病程相关蛋白基因、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。     

小麦幼胚再生培养体系优化及优良转化受体基因型的筛选

为建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养体系,以20个优良小麦推广品种为材料,对以幼胚为外植体的愈伤诱导、分化和生根壮苗培养基进行筛选.结果表明,添加500 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L脯氨酸、100 mg/L谷氨酰胺,并以40 g/L麦芽糖为碳源的MXD2培养基的出愈率最高,愈伤质量最好.以大量元素减半的1/2 MX为基本分化培养基,添加1 mg/L ZT和0.5 mg/L IAA对愈伤组织诱导分化的效果最好,分化率最高达到83.0%.以1/2 MX培养基中添加0.5 mg/L IAA和0.5 mg/L MET的生根效果最好,且移栽成活率高.不同基因型的组织培养特性差异显著,筛选到扬麦158、南农9918、济麦20、宁麦9号等8个基因型可作为优良的转基因受体材料,并初步建立起适合于它们的植株再生体系.     

受白粉菌诱导表达的簇毛麦草酸氧化酶基因(Hv-OxOLP)的克隆和分析

为了筛选抗白粉病基因Pm21介导的抗病途径中的防卫基因，采用芯片杂交技术筛选携带或不携带Pm21基因的材料之间或抗病材料经白粉菌诱导与非诱导样品之间的差异表达基因，并采用RT-PCR方法分析了被筛选出的草酸盐氧化酶类似蛋白基因（Oxalate Oxidase Like Protein，OxOLP）的表达情况，进一步利用TAIL-PCR方法分离簇毛麦基因Hv-OxOLP中的全长序列。芯片杂交结果表明，探针Contig3156（一个推导的草酸盐氧化酶类似蛋白基因）在抗病簇毛麦中受白粉菌诱导的程度最大，在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明，在抗、感白粉病的材料中草酸盐氧化酶类似蛋白基因都受白粉菌诱导表达，但在抗病材料中达到表达峰值的时间早。用TAIL-PCR方法分离的Hv-OxOLP有一个内含子和两个外显子，ORF包含690个核苷酸，在启动子区包含两个W-box，在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。作为一个受白粉菌诱导表达的基因，HpOxOLP在抗白粉病反应中可能起重要的作用。