利用表达分析和基因沉默方法研究硫代硫酸硫转移酶基因TaTST与小麦抗白粉病反应的关系

硫代硫酸硫转移酶参与植物体内的硫代谢、氰化物的清除以及活性氧的生成与清除,与植物抗病反应密切相关。小麦抗、感白粉病近等基因系材料在接种白粉菌后均诱导表达硫代硫酸硫转移酶基因TaTST,并在接种后0~48 h内呈现2次诱导峰值,分别与白粉菌初次接触识别和附着胞侵入、吸器形成时间相对应,也与2次氧突发时间对应。TaTST在感病材料上的诱导表达水平明显高于在抗病材料上,由此导致的活性氧过度清除可能是导致感病反应的原因之一。TaTST也参与抗病反应过程。利用病毒诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing, VIGS)创造了TaTST基因沉默的抗病植株。尽管充分发病时间后沉默植株叶片上并未观察到肉眼可见的病斑,但侵染早期白粉菌成功侵入频率的增加和次级菌丝的有限伸长说明TaTST沉默植株抗病水平下降。TaTST沉默导致乳突致密度下降和H₂O₂在细胞内的扩散时间延迟。因此,TaTST可能通过调节活性氧的积累和扩散、乳突的形成等小麦-白粉菌互作早期的寄主细胞反应而参与小麦对白粉菌的抗侵入过程。     

小麦白粉病菌诱导的TaWRKY34基因的鉴定与分析

WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用cDNA宏阵列(macroarray)和RT-PCR相结合的方法,从小麦全长cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的TaWRKY34转录因子,该基因编码464个氨基酸。染色体定位分析表明,该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上,并且只在细胞核中表达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关WRKY转录因子的亲缘关系较近,与其中的3个WRKY基因具有相似的表达模式。TaWRKY34在Pm16/北京8377抗白粉病近等基因系中,对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。     

白粉病菌侵染后小麦叶片蛋白质变化的研究

利用双向电泳技术,分析了高感白粉病和对白粉病表现免疫的2种小麦在接种白粉病菌前后的叶片蛋白的变化。结果表明:无论抗病小麦Pm3b还是易感小麦Chancellor,在白粉菌接种前后,叶片蛋白都有明显变化。都有部分蛋白消失。对于抗病小麦Pm3b,在白粉病菌接种后,在电泳图谱上还发现诱导产生许多新的叶片蛋白。经统计,在白粉菌接种后,抗病小麦Pm3b的叶片诱导产生至少20个新蛋白。推测可能与小麦受白粉病菌诱导后一些抗性蛋白大量表达有关。     

簇毛麦6VS特异转录序列P21461及P33259的获得及其分子标记在鉴定小麦-簇毛麦抗白粉病育种材料中的应用

簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂分别携带抗白粉病基因Pm21和Pm V,在与小麦的杂种后代中,抗病基因与外源染色体臂共分离。开发鉴定2条外源染色体臂间多态性的序列,尤其是遗传信息相对缺乏的6V#4S染色体臂的序列,对于其在遗传与育种上的应用具有重要意义。本研究以携带6V#4S·6DL染色体的小麦易位系Pm97033及感病小麦亲本宛7107接种白粉菌的叶片转录组数据为资源,通过差异基因筛选、共线性分析、簇毛麦基因组扩增及测序验证的方法,鉴定出来自6V#4S的表达序列P21461和P33259,其中基于P21461序列设计的引物P461-5在簇毛麦6V#2S和6V#4S染色体臂的扩增产物具有30 bp的In Del和4 nt的多态性。用该引物转化的标记P461-5a可以鉴定抗白粉病小麦品种和高代品系所含的外源染色体,显示其在簇毛麦抗源鉴别和小麦抗病育种辅助选择中潜在的应用价值。根据P33259开发的标记P259-1可以对含有6V#4S染色体臂的材料进行特异扩增,但对6V#2S·6AL易位染色体没有扩增产物,因此P259-1可作为6V#4S·6DL易位染色体的特异分子标记。q RT-PCR分析结果显示,P21461的表达不受白粉菌诱导,而P33259在接菌后12 h和24 h的转录水平比接菌前提高约2倍,推测其可能参与Pm97033与白粉菌的早期互作。     

栽培小麦Brock中抗白粉病相关基因TaRPP13-1B的克隆及功能分析

白粉病是小麦生产中的主要病害之一,发掘抗病基因并实现抗病基因转育是提高作物抗病性的最经济有效的方法。本研究克隆了一个位于小麦染色体1B上、具有典型CC、NBS和LRR结构域的基因TaRPP13-1B。接种白粉菌后, TaRPP13-1B基因在抗病小麦Brock和BJ-1中表达量虽然出现上下调波动,但平均表达水平一直高于感病小麦品种京411。采用病毒诱导的基因沉默和转基因过表达技术进行功能分析,发现抑制目标基因表达,抗病小麦品种Brock对白粉菌的抗性显著降低;过表达TaRPP13-1B的转基因小麦津强5号对白粉菌抗性明显提高。说明TaRPP13-1B基因参与小麦抗白粉病的防御反应过程。该研究为小麦抗病品种的选育提供了有价值的备选基因。     

植物抗病中的信号分子研究

综述了近年来在植物抗病中的信号分子研究方面所取得的进展,包括水杨酸、乙烯、茉莉酸、活性氧、一氧化氮、钙离子及其β-氨基丁酸等信号分子诱导植物防卫反应中的作用,同时阐述了水杨酸诱导植物防卫反应的机理以及生物合成途径,并对今后的研究工作进行了展望。     

小麦Pm21基因调控的白粉菌早期侵染抑制和寄主细胞反应

携带抗白粉病基因Pm21的小麦材料对白粉病免疫,叶片可见坏死斑。苗期人工接种小麦白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)和病原侵染初期的细胞学观察表明,在互作位点,携带Pm21基因的抗病材料上表皮细胞乳突形成时间与感病对照差异不明显,但乳突的大小、致密度、持续时间及乳突中H₂O₂染色较对照有明显差异,并由此显著降低白粉菌的侵入频率。抗病材料上发生多次侵染未成功导致白粉菌附着胞畸形。对于少数成功侵入并形成吸器的白粉菌,抗病材料表皮细胞发生过敏性反应,限制白粉菌吸器和二级菌丝的发展。因此,Pm21调控的白粉病抗病反应在细胞水平上表现为细胞壁加固和过敏性反应的发生。     

3个受白粉菌诱导的小麦抗病相关基因的表达分析

小麦白粉病是小麦生产上的重要病害。研究小麦抗白粉病的分子机理,利用抗病基因是控制小麦白粉病的有效途径。此研究根据前期白粉菌诱导后获得的可能与农家小麦品种红蚰麦抗病相关序列的分析结果,合成了几丁质酶,交替氧化酶（Alternative oxidase,AOX）以及MAP激酶（促分裂素原活化蛋白激酶mitogen-activated protein kinases）类似物3个基因的定量PCR引物,实时分析了在白粉菌诱导条件下‘红蚰麦×豫麦13’的F3代纯合抗病植株与感病植株两种互作组合中3个基因的时空表达模式,该研究为揭示‘红蚰麦’抗白粉菌的分子机理提供了依据。     

病原诱导的中间偃麦草ERF转录因子基因的克隆及其表达特性

应用RT-PCR、RACE技术，从病原诱导的中间偃麦草叶片cDNA中，分离出1个编码ERF基因的全长cDNA序列，该基因暂命名为TiERF1a，编码由292个氨基酸组成的蛋白质，具有ERF转录因子典型的结构，即保守的AP2/ERF DNA 结合域、核定位位点和酸性激活区。TiERF1a的氨基酸序列与一个水稻ERF蛋白OsBIERF3具有66%的同源性，与拟南芥AtERF1同源性仅39.7%，为植物ERF转录因子家族B3亚群的一个新成员。表达分析结果表明，纹枯病菌、赤霉病菌侵染可诱导TiERF1a基因的上调表达，与防卫相关的激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因上调表达，且TiERF1a对外源乙烯、茉莉酸的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌响应时期，说明TiERF1a可能通过乙烯、茉莉酸信号途径参与寄主调控对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱

小麦农家品种红蚰麦携带1对显性抗白粉病新基因,暂命名为Pmhym。为了深入了解该品种抗病的分子机制,用豫麦13/红蚰麦的F₃代纯合抗病株系构建抗池,并对白粉菌接种后24 h的基因表达谱,采用Affymetrix小麦基因芯片进行分析,以白粉菌接种0 h为对照。在61 127基因微矩阵点中,有效差异表达Ratio值≥2或≤0.5的基因共5 282个,其中上调基因2 553个,下调2 729个。对上调序列的分类表明,功能明确的序列中39.81%与抗病/防御相关;下调表达基因中以能量代谢和抗病/防御相关基因比例最高,分别占26.71%和19.65%。上调表达在8倍以上的序列中81个的功能已知,其中包括病程相关基因、防卫反应基因、生成或清除活性氧的基因,以及抗病信号转导基因等。选取上调和下调表达8倍以上的共13个探针序列进行实时定量PCR验证,表明基因芯片数据具有良好的重复性。     

The resistance to leaf rust and powdery mildew of recombinant lines of barley (Hordeum vulgare L.) derived from H. vulgare × H. bulbosum crosses

A set of 23 recombinant lines (RLs) of barley ( Hordeum vulgare L.) derived from H. vulgare  ×  H. bulbosum L. crosses was inoculated with barley leaf rust ( Puccinia hordei ) and powdery mildew ( Blumeria graminis f.sp. hordei ) at the seedling stage to identify their levels and mechanisms of resistance. Eight RLs were studied further in glasshouse and field tests. All three barley parents ('Emir', 'Golden Promise' and 'Vada') were highly susceptible to powdery mildew and leaf rust isolates. Several RLs showed partial resistance expressed as high relative latency periods and low relative infection frequencies against leaf rust. This high level of partial resistance was due to a very high level of early aborting colonies without host cell necrosis. Several RLs showed hypersensitive resistance to some or all isolates. For powdery mildew, one RL was completely resistant to the CC1 isolate and had a hypersensitive resistance to the CO-02 isolate. Three RLs derived from 'Emir' were completely resistant to both powdery mildew isolates, and three more RLs tested in the field had higher levels of partial resistance than their parents. The results indicate that H. bulbosum contains major and minor gene(s) for resistance to leaf rust and powdery mildew that can be transferred to cultivated barley.     

小麦地方品种小白冬麦抗白粉病基因分子标记

小麦农家品种小白冬麦对小麦白粉病具有良好抗性,对病原菌拥有较广的抗谱,并与其他已知抗白粉病基因的抗谱不同,遗传分析证实小白冬麦的苗期抗性由一个隐性抗白粉病基因控制。为了寻找与小白冬麦所携带抗白粉病基因连锁的分子标记,采用小白冬麦和感病品种Chancellor(CC)正反交组合,在2个F₂群体125和107个单株上进行验证。结果显示,抗白粉病基因mlxbd与引物Xgwm577、Xgwm1267等紧密连锁,通过中国春及其第7部分同源群缺体-四体系,双端体系和缺失系将其定位在7B染色体长臂末端区域(7BL-10,Bin 0.78~1.00), 利用与mlxbd最近的引物Xgwm577扩增23个含有已知抗白粉病基因的小麦品种,检测发现这个引物不能单独用于分子标记辅助选择育种。     

小麦新种质N95175抗白粉病基因的染色体定位

白粉病是影响小麦生产的病害之一。小麦种质N95175对小麦白粉病免疫,为了定位它所携带的抗白粉病基因的染色体位置,对其苗期白粉病抗性进行了遗传分析。4个感白粉病普通小麦品种与N95175杂交,F1对白粉病均表现高抗,F2抗感分离比例均符合期望比例3 1;21个感白粉病普通小麦缺(单)体系与N95175杂交,F1对白粉病均表现高抗,F2白粉病抗感比例除阿勃6AN×N95175组合偏离期望比例3 1外,其余组合均符合期望比例3 1。结果表明,N95175苗期白粉病抗性由位于小麦6A染色体上的1对完全显性基因控制。     

12个小麦品种(系)白粉病抗性的遗传分析

利用17个不同来源和毒力的白粉菌菌株对12个小麦品种(系)进行苗期抗性鉴定和抗病性遗传分析,同时利用Pm2和Pm8基因的特异分子标记检测了相应基因。供试的12个品种至少能够抗11个白粉菌菌株。用E09、E20和Bg2菌株接种F₂群体,抗感植株分离比例和适合性测验证明这12个品种对不同白粉菌菌株的抗性均受1对显性基因控制。抗谱分析和基因紧密连锁分子标记(Xcfd81)分析表明良星66很可能含有Pm2或其等位基因。ω-黑麦碱基因(1RS染色体)和Glu-B1基因(1BS染色体)特异分子标记分析结果证明,山农20和郑麦9962含有T1BL·1RS易位染色体,即可能携带Pm8基因。由于Pm8基因对大多数菌株表现感病,所以这2个品种除Pm8外,还具有其他抗病基因。偃展4110与天民668对参试菌株的反应型表现一致,其他材料对不同菌株的反应型表现不同。     

河南小麦新育成品种(系)白粉病抗性鉴定与分子标记检测

利用华北地区流行的白粉菌菌株E09和E20,分别对河南省小麦新品种(系)区域和预备试验参试材料908份(2009—2013年度)和412份(2009—2012年度)进行苗期白粉病抗性鉴定,同时利用与Pm2、Pm4a、Pm8和Pm21基因连锁的分子标记检测相关抗病基因的分布。结果显示,抗E09的材料占21.9%(199/908),抗E20的材料占9.5%(39/412),同时抗E09和E20的材料仅占3.6%(15/412)。在908份供试材料中,580份含有1BL/1RS,占63.9%,含Pm8或新的1RS来源抗白粉病基因;另有2份材料含6AL/6VS来源广谱抗白粉病基因Pm21,8份可能携带Pm2,2份可能含有Pm4a;有6份材料可能含有多个抗白粉病基因。表明河南省近年育成的小麦新品种(系)依然含有对我国白粉菌菌系有效的抗白粉病基因,但抗源遗传基础较窄,部分已经或正在丧失抗性,应加快引进和利用新的多样化抗病基因资源。     

两个抗小麦白粉病新基因的遗传分析与染色体定位

YU25是从八倍体小偃麦TAI7047与小麦栽培品种川麦107杂交后代中选育出的对白粉病免疫的小麦育种新材料。以感白粉病小麦品种MY11与YU25杂交和回交的后代F₁、F₂、BC₁F₁和BC₂F₁为材料,采用四川省当前流行的小麦白粉病优势生理小种人工接种,对YU25的白粉病抗性进行了遗传分析。结果表明,YU25含有2对表现免疫反应和高抗反应的显性抗病基因,暂命名为PmE(免疫)和PmYU25(高抗)。用294对小麦微卫星引物和221个F₂植株,对这2个基因进行连锁分析,发现小麦微卫星标记Xgwm-297-7B与PmE基因的遗传距离为13.0 cM,而Xgwm-210-2D与PmYU25基因的遗传距离为16.6 cM,因此将PmE和PmYU25分别定位在7BS和2DL上。根据系谱和基因位点分析,推断PmE和PmYU25均为起源于中间偃麦草、不同于已知的抗小麦白粉病基因的2个新基因。小麦育种新材料YU25含有可能来源于小麦-中间偃麦草的染色体多重易位,其细胞学基础和在实际育种中的应用值得进一步研究。     

Resistance of Triticum dicoccoides to infection with Erysiphe graminis tritici

Summary The reactions of 233 Triticum dicoccoides acessions, collected at 10 sites in Israel and elsewhere, to infection with cultures of Erysiphe graminis tritici, were determined. The reactions indicated that the number of sources of resistance to E. graminis tritici which can be obtained from T. dicoccoides plants growing wild in Israel and elsewhere is almost unlimited. One hundred and fourteen or 49% of the accessions were resistant, and 137 or 59% of the accessions were resistant or moderately resistant to infection with four cultures of E. graminis tritici which possess the virulence genes corresponding to most of the identified resistance genes in wheat. Accessions collected at sites with marginal habitats where T. dicoccoides grows poorly and has lower grain weight, were more susceptible than were accessions collected at sites with an optimal habitat for growth of T. dicoccoides. The results agreed with those in a previous study with Hordeum spontaneum, and indicate that to obtain H. spontaneum or T. dicoccoides accessions with the highest level of resistance to the powdery mildew pathogens, plants should be collected at sites in ecological and geographic regions where those two species occupy optimum habitats and are exposed to the powdery mildew pathogens.     

小麦近等基因系与白粉病菌互作的生理指标研究

小麦品种百农3217感白粉病,它的一个近等基因系(Xbd/百农3217(BC7F6))含抗病基因xbd,具有抗白粉病功能。以这两个品系为试验材料,接种白粉菌,分析了0~6 d两个品系叶片中过氧化氢(H2O2)的含量和7种代谢酶的活性,这些代谢酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽转硫酶(GST)等。目的是探讨在白粉菌和小麦植物的互作过程中,感病、抗病植物生理指标之间的差异。试验结果表明:接种白粉病菌后,H2O2含量在感病品系中显著下降,在抗病品系中显著上升;在白粉菌侵染进程中,CAT酶活性,感病与抗病品系无明显差异;感病品系叶片内SOD、GR、GPX、APX和GST活性在接种后期显著上升,高于抗病品系;DHAR活性变化则无明显规律。在白粉病侵染小麦植株过程中,H2O2具有重要作用,多种代谢机制共同参与,各种酶的总体表现影响了H2O2含量的变化。