猴D型逆转录病毒P27基因的表达、纯化及重组蛋白的鉴定

根据GenBank上已发表的猴D型逆转录病毒SRV-2株基因组序列设计合成了一对特异性引物,通过PCR扩增出P27基因。将扩增出的片段克隆到原核表达载体pBAD/Thio-TOPO上,通过序列分析证实该片段与猴D型逆转录病毒SRV-2株P27基因序列一致。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌T0P010中,用阿拉伯糖诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和WesternBlot分析,并用proBondTM柱在天然状态下进行纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为50KDa,其大小与预期相符。     

空肠弯杆菌研究现状

空肠弯杆菌是一种人兽共同感染的病原菌,也是导致腹泻最常见的病菌,主要症状是发热和急性肠炎。主要从病原的生物学特征、肠毒素的研究、人畜带菌率及流行病学的研究现状进行综合讨论     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72 kDa。Western blotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

羊痘病毒

羊痘病毒能引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病.作者着重综述山羊痘和绵羊痘.羊痘病毒的基因组较大,山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组非常相似,但自然条件下一般不会发生交叉感染.临床症状主要以发热和全身性丘疹或结节为特征,结合其临床症状实验室用透射电子显微镜检测病毒粒子的典型形态即可做出快速诊断.病毒培养和分离虽有较高的特异性,但耗时长;因羊痘病毒和副痘病毒有相似的血清型,一些血清学的诊断方法如琼脂扩散试验(AGID)、间接免疫荧光试验、检测抗体的ELISA等,因会出现抗体交叉反应而无法区分这2种病毒的感染;又因羊痘感染后主要引起细胞介导免疫,动物接触病原后仅产生低水平的中和抗体,故而病毒中和试验敏感性也不高.近年来,用于ELISA检测抗原的方法已经建立,具有较高的特异性;Western印迹试验利用羊痘病毒的P32抗原与待检血清反应,具有较好的敏感性和特异性,但价格昂贵、操作难.PCR可用来检查活体或组织培养品中羊痘病毒基因组;在此基础上发展了多重PCR技术,不但敏感性和特异性更强,且大量节省了时间和精力.治疗羊痘病毒无特效药,做好疫苗接种等防制措施很关键;目前采用活疫苗和灭活疫苗来控制本病,所有被鉴定的羊痘病毒毒株都有一个相同的主要中和位点,可以交叉保护.灭活苗的免疫保护期短.以羊痘病毒基因组作为其他反刍动物病原基因的载体,生产新一代羊痘病毒基因工程疫苗,具很大潜力.     

猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒（SVDV）高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDV RNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDV RNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

出口秦岭羚牛检疫

按照《中华人民共和国向日本出口展览用羚牛的卫生要求》,我们对赠送日本的4头秦岭羚牛实施为期90天的隔离检疫,并完成了对口蹄疫、蓝舌病、牛肺疫等12种疫病实验室检疫工作,4头羚牛检疫合格,均符合日本提出的要求,于2011年1月25日由西安咸阳机场启程到日本落户。     

猴嗜T淋巴白血病病毒研究进展

猴嗜T淋巴白血病病毒（simian T-cell lymphotropic virus,STLV）是非特定病原体（SPF）猴必须排除的病毒之一,是非人灵长类动物的一种重要的逆转录病毒,其潜伏期较长,非人灵长类动物感染了这一病毒在很长时间内无明显临床症状。目前,STLV已经遍布全球的非人灵长类,并可分为3种类型。研究证明STLV与非人灵长类动物的T淋巴白血病和淋巴肿瘤有关,其主要传播方式是通过血液传播。作者主要介绍了STLV的病毒学特点、流行及检测方法等的研究进展。     

竞争酶联免疫吸附试验检测蓝舌病抗体的研究

用已研制的BTV－11型VP7单克隆抗体建立了竞争酶联免疫吸附试验（C－ELISA）检测蓝舌病抗体的方法，并与琼脂免疫扩散试验（AGID）进行了检测比较，C－ELISA特异性强，不与相关环状病毒发生交叉反应，敏感性比AGID高。用研究制备的C－ELISA诊断试剂盒和美国、澳大利亚制备的诊断试剂盒对1377份临床样品的检测，以及对实验动物人工感染后抗体动脉检测。三种诊断试剂盒检测结果一致，且重复性好。本研究建立的蓝舌病C－ELISA是一种特异性强、敏感性高的蓝舌病抗体检测方法。     

猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建

根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。