棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T_3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件Wo LF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T_3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。     

植酸酶基因PhyA对陆地棉产量性状的影响

在人工控制(培养基、水培、沙培)条件下,植酸酶基因PhyA具有分解利用培养基质植酸磷、提高磷素利用效率的功能,但在田间的表现目前尚未明确。在前期完成的PhyA转基因陆地棉新材料盆栽试验基础上,将其种植在田间条件下,研究PhyA基因对棉花产量性状的影响。结果表明,部分转基因棉花新材料的单株结铃数、铃重、衣分、籽棉产量、皮棉产量与野生型对照存在显著差异,PhyA在田间条件下具有改良转基因棉花部分产量性状的能力。在此基础上,遴选出2个转PhyA棉花优良新品系G3、G2,可用作今后转植酸酶基因棉花新品种培育的基础材料。     

棉花分子遗传图谱构建和纤维品质性状QTL分析

以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中棉所8号和海岛棉(Gossypium barbadense L.) Pima90-53组配衍生的214个单株的F₂群体为材料,构建了包含110个SSR标记和65个AFLP标记的遗传连锁图谱。该图谱共包括42个连锁群,连锁群长度为4.5~147.3 cM,包括2~22个分子标记,标记间平均距离为11.6 cM,总长为2 030 cM,约占棉花全基因组的40.6%。应用复合区间作图法分析该组合的F₂单株和F_2:3家系纤维品质性状,共得到25个纤维品质数量性状基因座(QTL),其中5个与纤维长度相关s,分布在Chr.21、Chr.15、LG2和LG12上,可解释表型变异的10.2%~35.8%;4个与整齐度相关,分布在Chr.21、LG9、LG18和LG12上,可解释表型变异的12.6%~36.6%;7个与马克隆值相关,分布在Chr.9、LG1、LG9、LG20和LG12上,可解释表型变异的11.5%~26.1%;7个与断裂比强度相关,分布在Chr.21、Chr12、Chr.8、LG1、LG4和LG10上,可解释表型变异的16.5%~52.8%;2个与伸长率相关,分布在Chr.9和Chr.21上,可解释表型变异的18.1%和27.1%。LG9、LG12和Chr.21上存在QTL聚集区。     

棉花抗枯黄萎病品种耐低磷种质筛选

 采用蛭石栽培和营养液浇灌的方法,研究棉花品种耐低磷筛选指标,利用这些指标对88份棉花抗枯、黄萎病品种进行磷素利用率极端基因型的筛选。结果表明,株高和根冠比在不同品种和不同磷浓度处理之间无显著差异,而棉苗干物重、地上部鲜重、总叶面积、叶绿素含量、地上部干物重及磷利用率在不同磷浓度处理和不同品种之间均存在显著差异,可以作为棉花苗期耐低磷能力的评价指标。利用这些指标对棉花抗枯、黄萎病品种进行了分析。聚类结果将88个品种主要分为耐低磷基因型和非耐低磷基因型两大类,分别包括25个和55个品种。其中,中棉所21、中99和陕棉11属于耐低磷的极端基因型。     

农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究

为建立一种转化效率高、稳定性好的棉花农杆菌遗传转化体系,以优良的陆地棉品种晋棉14、陕724为受体材料,利用农杆菌介导的方法,将含有根特异性表达启动子的植酸酶基因(PhyA)转入供试品种的胚性愈伤中;对获得的再生植株进行PCR检测,证明PhyA已经被插入到棉花基因组中,晋棉14和陕724的转化效率分别为33%和8.3%;此外,还对影响农杆菌侵染棉花胚性愈伤转化效率的因素,如卡那霉素浓度、胚性愈伤组织生长状态、受体材料的基因型等进行了较为系统的比较研究.     

表面活性剂LAS在棉花高通量DNA提取中的应用

本研究以棉花种子和叶片为材料,探索一种适用于棉花DNA高通量提取的方法。通过在裂解液中加入APG、LAS、CPB、DTAB、Tween80、SDS和CTAB 7种不同表面活性剂,比较其在棉花种子和叶片中的DNA提取效果,并与磁珠法和氯仿抽提法两种高通量纯化方法结合,对比传统SDS和CTAB提取液提取效果。结果表明,加入LAS表面活性剂的裂解液提取的DNA效果较好,提取棉花种子和叶片的浓度可达2 127.61和572.70 ng/μL,OD260/280分别为1.97和1.98,上清液清澈透明。LAS与两种纯化方式结合的DNA提取效果都明显优于传统CTAB和SDS提取液的提取效果,其中LAS与氯仿抽提的纯化方法结合提取效果最好,且DNA提取通量可达到600个样品/2 h。LAS表面活性剂能在棉花种子和叶片DNA提取中都能起到促进作用,与氯仿抽抽提纯化方法相结合可兼顾DNA提取通量与质量,能满足后续大部分分子实验要求。     

中国棉花抗枯、黄萎病品种抗性和产量性状改良进展

对20世纪50年代以来中国自育的110个棉花抗枯、黄萎病品种的抗病性、产量性状、早熟性状的遗传改良进行了分析。结果显示,抗枯萎病育种成效显著,品种对枯萎病抗性呈稳步上升趋势;品种对黄萎病抗性亦呈上升趋势,但进展缓慢。除20世纪70年代品种略有下降外,品种的单株生产力呈上升趋势。单株结铃平均数在年代间变化不大,衣分变化趋势呈“V”字型,90年代品种最高。20世纪50~90年代,品种生育期缩短,早熟性增强。株高、第一果枝距子叶距离、第一果枝节位变化趋势一致,呈下降趋势。     

常规亲本差异对转基因抗虫杂交棉性状的影响

采用河北省生产上利用的常规新品种（品系）与抗虫品种组配杂交组合，分析了常规亲本差异对转基因抗虫杂交棉的影响。结果表明，常规亲本之间抗虫性表现出明显的差异。低酚棉品种抗虫性较差。但转基因抗虫杂交棉的抗虫性受常规亲本的抗虫性影响较小，同一抗虫亲本不同组合之间的抗虫性表现出明显的差异。表明转基因抗虫杂交棉受常规亲本遗传背景的影响，常规品种在不治虫条件下产量因素的下降幅度与其抗虫性无明显关系。转基因抗虫杂交棉单株结铃数与常规亲本的结铃数无明显关系。单铃重及衣分受常规亲本单铃重及衣分的影响，但增减趋势不完全一致；然而产量构成因素受抗虫亲本影响较大。表现出随抗虫亲本增加而增加的趋势，转基因抗虫杂交棉单株结铃数与单铃重之间存在相互制约关系。单株结铃数大幅度的增加将造成单铃重的下降，衣分受两者的影响较小。     

转基因抗虫无色素腺体棉花营养价值研究

通过对河北农业大学棉花遗传育种室培育的转基因抗虫无色素腺体棉花新品系KW1、KW2、KW3、KW4、KW5的营养成份进行测定。结果显示:转基因抗虫无色素腺体棉花棉仁和棉秆酚含量分别为0.018%、0.019 5%,脂肪含量分别为36.5%、3.8%;棉箔的蛋白质含量为42.6%,含有11种氨基酸;棉秆蛋白质含量为14.2%。通过对棉花副产品生产潜力分析可知,推广转基因抗虫无色素腺体棉花,可以很好解决可耕地减少与人口增加、粮棉和粮饲的矛盾。     

西瓜枯萎病菌遗传分化研究

本试验利用21个RAPD随机引物对50个西瓜枯萎病菌系进行了RAPD扩增,研究了病菌遗传多样性。结果表明,对供试菌系扩增出134条带,其中多态性带113条,占总带数的84.3%。菌系间的遗传相似系数变化在0.45~0.93之间,多数菌系间的同源程度较低。基于RAPD标记聚类分析表明,50个菌系划分为6个RAPD群(RAPDgroups,简称RGs),即RGⅠ,RGⅡ,RGⅢ,RGⅣ,RGⅤ和RGⅥ。其中RGⅠ和RGⅡ各含有一个菌系,分别来自秦皇岛和新疆;RGⅢ和RGⅤ包括2个菌系,分别来自秦皇岛、承德和廊坊、沧州;RGⅣ包括唐山、石家庄、邯郸和新疆菌系;其余的菌系属于RGⅥ。分类结果进一步说明西瓜枯萎病菌间存在着较大的遗传分化。