水稻白叶枯病菌及其毒素引起烟草叶片组织坏死机制的研究

 水稻白叶枯病菌JXO Ⅲ细胞悬浮液及其分泌的毒素溶液接种到烟草叶片中,都能在烟草叶片上产生快速的坏死反应。引起坏死反应所需的最短时间分别为接种后8 h和0.5 h。低浓度的JXOⅢ(< 107 cfu/ml)接种后36~48 h内形成褪绿斑,而低浓度的毒素(< 2.5 mg/ml)接种后随时间延长在接点无任何可见变化。依文斯蓝(Evans blue)染色发现,毒素和JXOⅢ分别在接种后0.5 h和6 h内细胞大量死亡。叶圆片法测定表明,接种毒素后2 h内烟草细胞膜透性迅速上升,接种JXOⅢ后9 h细胞膜透性开始明显上升。毒素处理的烟草叶片中LOX、POX、SOD、CAT活性水平较对照降低,而JXOⅢ处理中上述酶活性较对照有不同程度的增加。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺,RNA合成抑制剂放线菌素D和钙离子通道阻断剂氯化镧分别以7.1×10^-5 M、1×10^-4 M和1×10^-3 M浓度有效地抑制JXOⅢ在烟草上形成坏死反应,这些抑制剂对毒素在烟草上的坏死反应则没有影响。     

水稻黄单胞菌水稻变种的rpfA基因的定位和次级克隆

水稻黄单胞菌水稻变种产生两种顺乌头酸酶（ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）,编码ＸｏｏｃａｎＡ的ｒｐｆＡ基因已被克隆在重组质粒ｐＧＸＮ３０００中。本工作通过转座子Ｔｎ５Ｂ２０诱变ｐＧＸＮ３０００,鉴定了ｒｐｆＡ基因的位置及其转录方向,并进一步将含有完整ｒｐｆＡ基因的４．８ｋｂＡｓｐ７１８ＥｃｏＲⅠ片段次级克隆到了多用途载体质粒ｐＩＪ３２００。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

水稻白叶枯病菌拮抗细菌B56菌株的拮抗活性研究

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后拮抗活性无明显变化。利用PhenylSepharose CL-4B疏水色谱柱和DEAE-Sephacel阴离子交换柱分离B56 菌株初提液, 得到一个具有拮抗活性的洗脱峰。该洗脱峰经SDS-PAGE检测发现具有一条分子量约为36 kD 的蛋白带。质粒提取和检测发现B56菌株存在一个稳定的内源质粒。     

生物及非生物诱导因子对水稻白叶枯病的诱导抗性及其与活性氧代谢的关系

 以对白叶枯病高抗的水稻品种余水糯和高感的水稻品种浙辐802为材料,于2叶期用Tiron、Paraquat(PQ)和稻白叶枯病菌弱毒株75-1进行诱导处理,测定诱导处理后3、24、48、72 h叶中超氧化物歧化酶(SOD)活性、O2-产生速率及丙二醛(MDA)含量的动态变化,并于3叶期用白叶枯病菌强毒株76-25进行挑战接种,结果表明：75-1和PQ均诱导两品种产生了系统抗性,并使诱导叶中O2-产生速率和MDA含量增加。75-1使O2-产生速率在24 h达峰值,比对照升高30.6%(余水糯)和25.3％(浙辐802);而PQ使O2-产生速率在24～72 h维持较高水平,比对照升高49.4％(余水糯) 和39.7％(浙辐802)。MDA含量的变化晚于O2-产生速率的改变,在72 h达最高值。75-1使SOD活性降低,并在24 h达最大降幅;而PQ使SOD活性升高,并在48 h达峰值。Tiron使PQ和75-1的诱导效果减弱,并使75-1对余水糯和浙辐802的互作由非亲和性互作转变为类似亲和性互作,导致侵染斑的形成。     

芒果细菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆与序列分析

根据黄单孢菌属LuxR基因的同源性设计简并引物XF/XR,采用同源克隆法从芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)中获得了约1.4 kb的DNA片段。经测序和序列同源性分析表明,该基因片段长1 422 bp含有一个完整的LuxR同源基因,并命名为XcmR。生物信息学分析表明,XcmR基因完整ORF(开放阅读框)全长765 bp,编码254个氨基酸,分子质量和等电点分别约为28.2 ku和8.9,与GenBank中公布的Xanthomonas属LuxR或AhyR/AsaR氨基酸序列具有86%~99%相似性。系统聚类结果表明,XcmR与来源于柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、番茄疮痂病菌(X.c.pv.vesicatoria)、水稻白叶枯菌(X.oryzae pv.oryzae)和甘蓝黑腐病菌(X.c.pv.campestris)的LuxR蛋白聚成一支。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,XcmR是LuxR蛋白家族的一员,具有LuxR蛋白相似结构。     

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

 用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc) RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的Harpin_Xoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLP_Xooc)。     

水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析

 酸性还原酮加双氧酶(ARD)催化很多原核和真核生物中的甲硫氨酸急救途径(MSP)倒数第二步。本研究鉴定了水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)中的酸性还原酮加双氧酶, 命名为xard。Xoo 菌株PXO99^A、MAFF311018和KACC10331中的xard核苷酸序列完全相同。xard基因突变菌株在甲硫基腺苷(MTA)为唯一硫源时不能正常生长。这一结果证明Xard在MSP中起作用。xard突变体和野生型菌株PXO99^A 接种水稻IR24后病斑长度数据表明该基因突变对Xoo在水稻上的毒性没有影响。     

热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一.为快速准确地鉴定Tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和Tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)Tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体.结果显示,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别Tn5的插入位点和相应的功能基因.TAIL-PCR鉴别的5株突变体是Tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;Tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是Tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上.序列同源性分析发现,8株突变体Tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%.这表明,TAIL-PCR和Tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌Tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离.