菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据PMWa V-3外壳蛋白基因的保守区域设计特异性引物和探针,通过优化PMWa V-3实时荧光定量PCR检测体系,构建以重组质粒为标准品的标准曲线,建立起PMWa V-3实时荧光定量PCR检测方法。【结果】该方法能特异性地检测PMWa V-3,且灵敏度是普通RTPCR的10倍;该方法重复性良好,组间和组内变异系数均小于1.73。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法是一种快速、简便、可信度高的PMWa V-3定量检测方法。     

荧光定量PCR技术研究进展及其在植物遗传育种中的应用

荧光定量PCR（Fluorescence in Quantitatire PCR，FQPCR）技术是20世纪90年代发展起来的一种新的核酸定量技术，具有高准确性、高特异性等特点，在生物科学和医学研究中发挥着极大的作用。本文综述了荧光定量PCR技术的原理、荧光探针类型及其在植物遗传育种中应用。     

一种快速低廉的PCR探针标记方法

【研究目的】探针标记技术是分子生物学和基因工程研究中常用实验技术,需要发展高效、快速、低成本、安全、简捷的DNA探针标记方法;【方法】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,电泳和Southern杂交检测探针标记结果;【结果】电泳检测发现标记产物在电泳时相对非标记的对照表现明显滞后,表明探针标记成功;电泳条带清晰明亮,表明探针标记效率高;Southern杂交条带清晰,说明该方法标记的探针可用于Southern等分子杂交实验;【结论】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,是一种低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。     

实时荧光PCR技术定量检测转基因大豆方法的研究

以转基因大豆Roundup Ready为材料，通过特异性引物和探针，对转基因大豆中外源基因cp4-epsps进行了定量检测。研究发现Taqman荧光探针法和SYBR荧光染料法均可作为转基因大豆定量检测的方法，但前者比后者具更高的检测灵敏度和精确度，其检测阈值可降到0.05%，变异系数为0.09%~0.53%。在此基础上，建立和优化了Taqman探针实时荧光定量PCR检测技术体系，有助于提高转基因作物及产品的生物安全性定量检测的准确度和可靠性。     

抗福美双假单胞菌株的NTG化学诱变及分子探针鉴定

利用微生物的抗药性筛选抗福美双的假单胞菌株Ｔ４６，然后通过亚硝基胍（ＮＴＧ）化学诱变获得了对福美双敏感的三株突变株Ｔ４６Ｎ１０、Ｔ４６Ｎ７和Ｔ４６Ｎ１７。利用这三个突变株作受体，通过基因克隆的方法筛选到了可使三个突变株恢复抗性的克隆，抗性基因分别被定位在７ｋｂ、２．５ｋｂ和２０ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ片段上。将这三个克隆分别用（３２）Ｐ标记后制成分子探针，然后分别与三个突变菌株的总ＤＮＡ进行ＤＮＡ－ＤＮＡ分子杂交，结果表明，各突变株均存在与菌株Ｔ４６的抗福美双基因克隆的高度同源性，经结合形态、生理生化等分析后证实这三株突变株均源自于出发菌株Ｔ４６。     

用生物素标记核酸探针检测鸭瘟病毒DNA的研究

用生物素-11-脱氧尿苷三磷酸(Biotin-11-dUTP),通过缺口平移法标记提纯的鸭瘟病毒 DNA,制备生物素化鸭瘟病毒 DNA 全基因组探针;以斑点杂交检测固定在硝酸纤维膜上的样品鸭瘟病毒 DNA 同源序列,杂交后用亲和素-碱性磷酸酶孵育,底物显色,阳性反应呈蓝紫色斑点。试验结果表明,生物素标记核酸探针可检出10pg 提纯的鸭瘟病毒DNA,并检出稀释10~5倍和肝组织鸭瘟病毒 DNA;对鸡马立克氏病毒 DNA,鸡痘病毒DNA 和噬菌体 DNA 无杂交反应;对鸭瘟病毒弱毒 DNA 产生微弱杂交。该技术具有快速、敏感、特异和无放射污染等优点。     

用核酸探针技术检测脊尾白虾体内的白斑综合症病毒

用斑点杂交和原位杂交检测了从病虾池捕获的脊尾白虾体内的WSSV。8尾脊尾白虾的斑点杂交检测阳性率为100%;脊尾白虾胃的上皮组织和结缔组织、位于鳃区头胸甲处的角化上皮、头胞甲反缘与虾体相连的角化上皮、结缔组织、附肢外的角化上皮、鳃丝的柱状上皮及其腔隙内的血淋巴、肝胰腺小管间的上皮组织及其血窦内的血淋巴、头胸甲的肌肉、造血组织、脊尾白虾精荚之结缔组织细胞、卵巢的结缔组织及其滤泡细胞原位杂交呈阳性。以上结果进一步证实了脊尾白虾是WSSV的天然宿主。     

南方根结线虫DNA指纹探针的分离

南方根结线虫ＤＮＡ指纹探针的分离徐建华１付鹏１杨金水２（１南京农业大学植物病原生物研究所，南京２１００９５；２复旦大学，上海２００４３３）ＩＳＯＬＡＴＩＯＮＯＦＰＲＯＢＥＳＦＯＲＤＮＡＦＩＮＧＥＲＰＲＩＮＴＩＮＧＯＦＭＥＬＯＩＤＯＧＹＮＥＩＮＣＯＧＮ...     

用DNA—RNA杂交检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫鸡ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点交和碱性磷酸酶为色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法。     

库尔勒香梨的苹果褪绿叶斑病毒cDNA探针检测技术研究

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对两种植物总RNA提取方法进行了比较研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨的提取方法;并利用RT-PCR反应体系成功合成了生物素标记的cDNA探针,在此基础上,对影响杂交灵敏度的主要因素进行了实验研究。结果表明,当探针浓度为400ng/mL,甲酰胺浓度为45%,42℃杂交反应6h,可获得最高灵敏度。Tween20的封闭效果比牛血清白蛋白好。对不同组织和不同提取方法提取的总RNA进行了杂交检测,并对库尔勒地区香梨带毒情况进行了检测。结果表明,不论幼叶、老叶、皮层及冷冻叶片均可出现杂交信号,两种提取方法提取的总RNA也都出现了杂交信号,库尔勒香梨样品有45%的带苹果褪绿叶斑病毒。