肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

一种快速检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光定量PCR方法

本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对，通过优化反应条件和反应程序，从而提高检测方法的灵敏性，并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测，并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明，基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对，能扩增2.2×10¹～2.2×10¹⁰copies·μL^-1的pMD18-I177L标准质粒，建立的标准曲线R²可达0.995 7,最低检测模板浓度为2.2×10¹copies·μL^-1;该方法扩增反应采用一步法，耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增，但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增；用该方法对170份临床样品进行检测，本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速AS...     

马铃薯类病毒(PSTVd)非放射性标记cDNA探针制备及其在检测上的应用

 利用含PSTVd单体克隆的重组质粒pGEM PSTVd,通过PCR扩增技术,用生物素标记制备cDNA探针,进行杂交反应检测PSTVd,其中通过化学颜色反应进行判读灵敏度可达50pg,而用化学发光反应进行判读灵敏度可达5pg,分别是R-PAGE检测灵敏度的26倍和260倍,且2种反应特异性和专化性较强。cDNA核酸斑点杂交反应(NASH)检测PSTVd方法准确、灵敏度高,一次检测样品数量多,且对异地样品检测非常方便,是以往其它检测方法的有效补充。     

Real-time PCR和常规PCR方法快速鉴定肉骨粉中的牛源性成份

疯牛病是一种严重危害动物和人类健康的疾病,其病原朊病毒可以通过食物链进行传播,因此建立准确的检测牛源性成份的方法非常重要.我们采用常规PCR和Real-time PCR中的TaqMan技术建立了快速鉴定牛源性成份的方法,使用Chelex-100提取肉骨粉中的DNA,过程简单可靠仅需要20min左右.对不同含量的牛肉骨粉进行检测,常规PCR能够检测到的最低含量是0.001%,而Real-time PCR对相同的样品进行检测所得到的灵敏度更高,最高可达到0.0001%,两种PCR方法的鉴定过程都非常简单快速,各需要2 h左右.这两种方法可以根据各实验室的不同条件作为肉骨粉鉴别的常规检测方法.     

番木瓜环斑病毒检测新技术的建立及其在病毒——原生质体体系探索中的初步应用

为了有助于全面了解和评价番木瓜完整植株对番木瓜环斑病毒(PRV)的抗、感病性机制,建立单细胞侵染模型是一个重要途径。本研究首次建立了PRV-番木瓜原生质体实验体系;建立了检测 PRV的间接Dot-ELISA和检测PRV-RNA的 cDNA分子探针的方法和技术,并利用这2个检测技术对PRV在番木瓜原生质体中的行为动态进行了初步探索。     

羊痘病毒实时荧光定量TaqManPCR检测方法的建立

参照羊痘病毒（CaPV）P32的基因序列，设计合成了2套引物和1条探针，建立了实时荧光定量PCR技术，对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示，用300nmol／L引物浓度和200nmol／L探针浓度，获得的CT值较小，而△Rn最大；可检测到相当于0．1TCID50的病毒DNA；制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽，相关系数为0．9995以上；组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％；与常规的PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量，可同时检测大量样品等优点。表明，荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法，可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列,设计合成了一对特异性引物,通过PCR的方法,扩增出了大小为470 bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段,制备了α毒素基因探针,该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应,与其它多种细菌DNA不发生反应;该探针在1∶1000的工作浓度下,能检出1~5pg/uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交(Dot-Blotting)检测,结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性,可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。