检测绵羊源爱知病毒D型荧光RT-PCR方法的建立和应用

绵羊源爱知病毒D型(ovine Aichivirus D)是在国内绵羊中新发现的病毒,本研究根据绵羊源Aichivirus D 3D基因序列设计检测引物,通过反应体系和条件优化,成功建立了检测绵羊源Aichivirus D的TB Green染料法荧光RT-PCR方法,该方法特异性和稳定性良好,灵敏度高。对2020年4月―2021年5月采集自四川6个场253份绵羊粪便样本(健康羊的133份,腹泻羊的120份)进行检测,结果该病毒的平均检出率为8.7％,场阳性率为66.7％。其中,腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(0.75%,P<0.001)。表明绵羊源Aichivirus D可能是引起以上地区绵羊腹泻的病原。从绵羊源Aichivirus D的阳性样本中成功克隆出大小为1 422 bp的13个完整的绵羊源Aichivirus D 3D基因,其核苷酸相似性为99.4％～100.0％。遗传演化分析发现这13株绵羊源Aichivirus D 3D基因与本实验室前期研究上传的绵羊源Aichivirus D 3D基因共同聚为单独的一个大支。本研究为绵羊源Aichivirus D的分子检测提供了一种新的方法和基础流行病学数据。     

4 株致病性大肠杆菌致犊牛腹泻的分离鉴定及毒力与耐药性分析

[目的]为查明致北疆地区某牧场犊牛腹泻的病原,对脱水濒死10日龄新生犊牛进行剖检,无菌采集充血肠系膜淋巴结2 份。[方法]通过采用培养、染色镜检、生化特性考察、PCR鉴定等方法来分离鉴定致病菌,并对分离致病菌株进行相关毒力基因检测及药物敏感性试验。[结果]经分离鉴定分离出4 株大肠杆菌,毒力基因PCR检测结果K99、Sta、irp2、Eae基因分别在163 bp、314 bp、301 bp、552 bp处有清晰条带,与预期[目的]片段大小相符;药物敏感性试验结果表明,分离株对头孢哌酮、链霉素、庆大霉素敏感,对恩诺沙星、卡那霉素高度敏感。[结论]犊牛腹泻要以预防为主,治疗建议采用对因治疗,并配合提高抵抗力的中兽药进行。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒E0-E2基因融合腺病毒的构建及小鼠免疫效果评价

【目的】 研究牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）E0和E2串联基因重组腺病毒作为基因工程疫苗的应用潜力。【方法】 采用PCR扩增、E0-E2基因融合并构建重组穿梭质粒pDC316-E0-E2,将其与AdMax腺病毒系统的骨架质粒共转染HEK293T细胞包装成重组腺病毒,通过Western blotting进行验证,并通过Reed-Muench法测定病毒滴度,通过肌内、皮下免疫接种小鼠后用ELISA方法及流式细胞检测进行免疫效果试验。【结果】 成功扩增到E0、E2基因目的片段,大小分别为681和1 122 bp,得到了完整的腺病毒Ad5-E0-E2;测定其滴度为1.1×10¹⁰ PFU/mL;Western blotting检测结果显示,Ad5-E0-E2外源基因在HEK293T细胞中表达,得到了与预期相符的目的条带（65 ku）;ELISA检测结果表明,通过肌内和皮下注射Ad5-E0-E2均能产生较高的抗体水平;流式细胞检测显示首免、二免后肌内和皮下注射Ad5-E0-E2组CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋比值均极显著高于PBS对照组（P<0.01）。【结论】 本试验成功构建重组腺病毒Ad5-E0-E2,且具有较好的反应原性和免疫原性,能诱导机体产生针对BVDV的特异性抗体。     

牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a (+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10% SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪的生长性能、血液生化指标和肠道吸收与屏障功能的影响

【目的】 试验旨在探讨槲皮素在防治仔猪感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用。【方法】 选取18头体重相近、健康的7日龄仔猪（杜×长×大）,随机分为3组（对照组、PEDV组和PEDV+槲皮素组）,每组6个重复,每个重复1头猪,试验期共11 d。经过3 d适应期后,于试验第4~10天给PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其他组仔猪口腔灌服等体积的人工乳,于试验第8天给PEDV组与PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服1×10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组灌服等体积的PBS溶液。试验第11天早上空腹称重,全部仔猪灌服D-木糖（0.1 g/kg BW）,1 h后经前腔静脉采血,检测血液生化指标、血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-木糖含量;将所有仔猪屠宰取空肠黏膜,检测肠道屏障相关基因,包括肠绒毛蛋白（villin）,紧密连接蛋白-1（claudin-1）,闭合蛋白（occludin）和肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）的相对表达量。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪平均日增重显著下降（P<0.05）,粪便评分显著升高（P<0.05）;血液中高密度脂蛋白含量显著降低（P<0.05）,肌酐和尿素氮的含量显著提高（P<0.05）;血浆中D-木糖含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、iFABP基因的相对表达量显著下调（P<0.05）。与PEDV组相比,PEDV+槲皮素组仔猪平均日增重和血浆D-木糖含量显著升高（P<0.05）;血液中肌酐和尿素氮的含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、villin和iFABP基因的相对表达量显著上调（P<0.05）。【结论】 10 mg/kg BW槲皮素可在一定程度上缓解PEDV感染导致的仔猪生长抑制和肾功能损伤,增强肠道吸收与屏障功能。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪肠道形态、抗氧化功能及空肠脂质代谢基因表达的影响

【目的】 通过研究槲皮素对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪肠道形态、肠道抗氧化功能及空肠脂质代谢相关基因相对表达量的影响,旨在探讨槲皮素对PEDV感染仔猪肠道的保护作用。【方法】 选取18头健康的7日龄断奶仔猪,随机分为3组：对照组、PEDV组和槲皮素＋PEDV组,每组6个重复,每个重复1头猪。试验期8 d,于试验第0~7天,对槲皮素＋PEDV组仔猪每天口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其余组灌服等体积的人工奶。于试验第5天晚上给PEDV组和槲皮素＋PEDV组仔猪口腔灌服10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组仔猪灌服相同体积的PBS溶液。于试验第8天早上屠宰,取仔猪十二指肠、空肠、回肠及结肠组织样品进行检测。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活力显著降低（P<0.05）,十二指肠、空肠、回肠和结肠中过氧化氢酶（CAT）的活力显著降低（P<0.05）,回肠和结肠中丙二醛（MDA）的含量显著升高（P<0.05）,空肠中载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B （APOB）、载脂蛋白C2（APOC2）、脂肪酸结合蛋白2（FABP2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL-3）和脂肪酸合酶（FASN）基因的相对表达量极显著下调（P<0.01）。与PEDV组相比,槲皮素＋PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著提高（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD的活力显著提高（P<0.05）,十二指肠、空肠和结肠中CAT的活力显著提高（P<0.05）,回肠和结肠中MDA的含量显著降低（P<0.05）,空肠中APOB、FABP2和FASN基因的相对表达量极显著上调（P<0.01）。【结论】 添加槲皮素可有效缓解PEDV感染导致的仔猪肠道损伤,提高仔猪肠道抗氧化能力以及空肠脂质代谢的能力。     

基于网络药理学及分子对接技术研究黄芪调控仔猪肠道菌群失调性腹泻的作用

【目的】基于网络药理学及分子对接技术研究黄芪调控仔猪肠道菌群失调性腹泻的有效活性成分及其作用机制。【方法】从TCMSP数据库搜集黄芪中药化合物成分,并获取其潜在靶点。利用GeneCards和OMIM数据库搜集肠道菌群失调性腹泻(flora imbalance diarrhea)的作用靶点,将两者预测的潜在作用靶点进行映射,获得共同作用靶点。运用STRING数据库构建靶点蛋白-蛋白相互作用(PPI)关系,用Cytoscape_3.8.0软件对其网络进行拓扑分析,用DAVID数据库对共同作用靶点进行富集分析,用AutoDuck_4.2.6软件对其核心成分与核心靶点进行分子对接。【结果】黄芪含有11个调控仔猪肠道菌群失调性腹泻核心成分,其对应靶点基因65个,疾病靶点854个,交集靶点25个。PPI网络中显示肿瘤坏死因子(TNF)、转录因子AP-1(JUN)、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、白细胞介素-6(IL6)、NF-κB抑制剂α(NFKBIA)、IL1B、IL10、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、C-C基序趋化因子2(CCL2)为关键靶点。GO功能和KEGG通路富集分析发现,黄芪有效成分主要通过美国锥虫病、炎症性肠病、阿米巴病、细胞因子-细胞因子受体相互作用、A型流感、疟疾、T细胞受体信号通路、沙门菌感染等信号通路参与转录调控、免疫反应、细胞对脂多糖的反应等生物过程。分子对接结果显示,槲皮素、山奈酚、芒柄花素等核心成分与TNF、IL1B等关键靶点结合紧密,亲和力较好。【结论】黄芪可能通过槲皮素、山奈酚、芒柄花素等主要活性成分作用于TNF、IL1B等靶点,通过参与美国锥虫病、炎症性肠病、疟疾、T细胞受体信号通路、沙门菌感染等信号通路进而治疗仔猪肠道菌群失调性腹泻。     

中东呼吸综合征的流行与研究进展

本文全面介绍了MERS的疾病概况、人间及动物间流行情况,目前该病已经蔓延到全球25个国家,造成1300余人感染、近500人死亡,并有4个国家发现骆驼MERS病例;总结了世界卫生组织（WHO）、世界动物卫生组织（OIE）和联合国粮农组织（FAO）等采取的防控措施,并从病毒来源、能否人际间传播、有效疫苗和药物研制等3个方面对MERS的研究进展进行了概述。目前认为,人类MERS的传染源可能是骆驼, MERS-CoV仅发生了有限的人传人,还没有研制出有效的特异性疫苗和药物。本文还简述了我国的防控情况,并提出了相关防控建议。