池塘养殖锦鲤体表溃疡病的组织病理学观察

为临床诊断和防治锦鲤Cyprinus carpio koi皮肤溃疡病,采用病理解剖方法对患病锦鲤进行临床观察和组织病理学分析,试验用患病锦鲤取自上海市朝阳锦鲤养殖场发病池塘,确定病鱼10尾(编号1~10),取每条病鱼的组织进行病理解剖、石蜡切片、H-E染色。结果表明:患病锦鲤体表溃疡病处的病灶组织出现严重淤血、炎性细胞浸润并聚集、肌束溶解和坏死等典型病理表现;体表溃疡病是由致病菌局部感染所致,并未全身性感染,10尾病料的脾组织均表现出血管扩张、管壁增厚、血管周围的实质组织凝固变性,伴有红细胞坏死和凝固变性区域内部分组织坏死等较为一致的病理特征,可以诊断为血液中有毒物质引起的脾组织病变,导致脾功能低下;肝胰组织和肾组织较脾组织病变相对较轻;肠、心、鳃、头肾组织等基本正常。研究表明,本病例全部样品均有不同程度的脾凝固变性、肝组织淤血、肾组织间质充血及其组织中血管扩张、管壁增厚的病理变化,这与体表溃疡病变无直接关联。     

鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶全长cDNA克隆及其在外周血白细胞中的差异表达分析

试验旨在获得鲤鱼诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)cDNA全长序列,并以此为基础探讨在丝裂原刺激下外周血白细胞中iNOS的表达变化。以从鲤鱼正常外周血白细胞cDNA文库中获得的iNOS的EST序列为基础,采用基因文库筛选和cDNA5'末端快速扩增技术(5'-RACE)相结合的方法,成功扩增出鲤鱼iNOScDNA全长序列,然后进行鲤鱼外周血白细胞原代培养,分成对照组和试验组,其中试验组分别为脂多糖(LPS,1.0μg/mL)刺激4、12h,刀豆蛋白A(ConA,1.0μg/mL)刺激4、24h,对照组为相同培养时间无丝裂原刺激的外周血白细胞,根据得到的iNOScDNA全长序列和鲤鱼β-actin序列分别设计特异性引物,应用实时荧光定量PCR方法检测各组外周血白细胞中iNOS在mRNA水平上的表达情况并进行分析。序列分析结果显示,最后获得的cDNA片段共3704bp,包含74bp的5'端非编码区,246bp的3'端非编码区,一个3384bp的完整的开放阅读框(ORF),共编码1127个氨基酸。序列同源性分析结果显示,该序列与鲫鱼iNOS基因同源性高达100%;实时荧光定量PCR结果显示,经LPS、ConA刺激的试验组外周血白细胞中iNOS表达量均升高,且短时间(4h)刺激的表达量高于长时间(LPS12h;ConA24h)刺激的表达量。综上所述,在LPS、ConA刺激过程中,iNOS在外周血白细胞中表达量均有上调,结果提示存在炎症反应的动态变化。     

丙氨酰-谷氨酰胺和γ-氨基丁酸对建鲤生长、饲料利用及体成分的影响

【目的】探讨丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)和γ-氨基丁酸(GABA)对建鲤Cyprinus carpio var.jian生长、饲料利用及肌肉营养成分的影响。【方法】在建鲤配合饲料中添加不同比例Ala-Gln和GABA,配成7种等氮(质量分数为32%粗蛋白质)、等能(17.0 MJ·kg-1)饲料,以添加Ala-Gln和GABA对建鲤生长最适添加量(6.0 g·kg-1AlaGln、90 mg·kg-1GABA)的添加组添加比例为100%,在此基础上等比例缩减和增加,Ala-Gln和GABA的添加梯度分别为0(0 g·kg-1Ala-Gln、0 mg·kg-1GABA)、20%(1.2 g·kg-1Ala-Gln、18 mg·kg-1GABA)、40%(2.4 g·kg-1Ala-Gln、36 mg·kg-1GABA)、60%(3.6 g·kg-1Ala-Gln、54 mg·kg-1GABA)、80%(4.8 g·kg-1Ala-Gln、72mg·kg-1GABA)、100%(6.0 g·kg-1Ala-Gln、90 mg·kg-1GABA)、120%(7.2 g·kg-1Ala-Gln、108 mg·kg-1GABA),共7组。饲喂初始体质量为45.59 g建鲤8周。【结果】与对照组相比,饲料中添加Ala-Gln和GABA的添加组,建鲤平均增质量率和特定生长率均显著提高(P0.05);其中60%添加组(3.6 g·kg-1Ala-Gln、54 mg·kg-1GABA)的饲料效率、蛋白质效率及肌肉中粗蛋白质含量均显著高于不添加的对照组(P0.05),其他各组之间差异不显著(P0.05)。【结论】饲料中添加Ala-Gln和GABA在一定程度上促进了建鲤幼鱼生长、饲料利用和肌肉蛋白质的合成,其中以3.6 g·kg-1Ala-Gln、54 mg·kg-1GABA组的效果最佳。     

Aerobic Bacterial Flora of Common Carp (Cyprinus carpio L.) Cultured in Earthen Ponds in Saudi Arabia

ABSTRACT

Quantitative and qualitative estimation of bacterial flora present in pond water, sediments, gills, and intestine of healthy common carp Cyprinus carpio cultured in Saudi Arabia were performed and identified to species level where possible. Mean total viable bacterial counts in pond water ranged from 1.2?±?2.9?×?10⁴ to 2.5?±?3.5?×?10⁵ cfu/mL; in sediments, 9.3?±?2.1?×?10⁷ to 2.7?±?3.5?×?10⁹ cfu/g; in gills filaments, 4.3?±?2.9?×?10⁶ to 1.6?±?3.9?×?10⁷ cfu/g; and in intestine, 8.7?±?4.1?×?10⁹ to 5.4?±?3.2?×?10¹⁰ cfu/g. Gram-negative rod-shaped bacteria dominated (76%) the populations. In total, 12 bacterial genera and 15 species were identified. Pond water and sediment bacteria had the reflection on bacterial composition of gills and intestine of carp. Intestinal bacteria showed more diversification in contrast to gill bacteria. Aeromonas hydrophila, Shewanella putrefaciens, Vibrio cholerae, Corynebacterium urealyticum, Vibrio vulnificus, Vibrio sp., and Staphylococcus sp. were the common bacteria in all the populations. In pond water and carp intestine, A. hydrophila, S. putrefaciens, V. cholerae, and C. urealyticum were the most dominant bacteria (prevalence ≥ 10%) where pond sediments and the carp gills experienced with more one dominant bacterium V. vulnificus. Only the A. hydrophila covered one fourth (25%) of the total bacterial populations.     

鲤和斑马鱼HOX基因家族同义密码子使用偏性的分析

运用CodonW程序计算和统计分析了鲤和斑马鱼HOX基因家族密码子组成、同义密码子使用频率。结果表明,鲤和斑马鱼HOX基因家族的最优密码子分别为6和9种。鲤和斑马鱼以A或u结尾的密码子发生强烈偏向;最优密码子的使用频率（Fop）与密码子适应指数（CAI）、密码子偏爱指数（CBI）、基因的G＋C含量（GC）,尤其是第三位密码子的G＋C百分含量（GC3S）之间呈极显著的正相关（鲤和斑马鱼的相关系数分别为r=-O．5946和0．7884、0．9772和0．9616、0．3356和0．5380、0．5424和0．8144）,而与有效等位基因数ENc存在显著负相关（相关系数r=-0．1241和0．3987）。实验表明：同义密码子第三位密码子碱基含量和组成直接影响着最优密码子使用偏性,基因的表达水平越高,对密码子的使用偏性越强。     

建鲤生长性状QTL区间及其与镜鲤同源性比对

以建鲤(Cyprinus carpio var. jian)F₁群体的94尾个体为材料, 利用254个微卫星标记构建了建鲤的遗传图谱, 并对体长、体高和体厚性状进行了QTL定位, 共检测到17个生长相关性状QTL, 分布在10个连锁群上, 解释表型变异为10.8%~35.2%。以相同的分子标记, 构建建鲤与镜鲤(Cyprinus carpio L.)的比较图谱, 分析了建鲤和镜鲤群体生长性状QTL的同源性关系。结果表明, 建鲤与镜鲤图谱具有广泛的共线性或同线性关系, 建鲤每个连锁群在镜鲤图谱中均找到了对应的同源连锁群, 其中建鲤10个生长性状QTL与镜鲤13个相同性状QTL具有同源性, 同源比例高达58.8%。同时发现, 建鲤QTL置信区间相对较大, 与之同源的镜鲤QTL置信区间较小, 通常位于建鲤QTL子区间内, 定位结果更精细。此外, 建鲤与镜鲤连锁群上都存在QTL的富集区域, 而这些富集区域常常存在于同源连锁群的共线性区域, 可作为标记辅助选择的重点区域。鲤通用QTL的发掘, 为分子标记辅助育种和更进一步的精细定位打下基础。

     

Inactivation of koi‐herpesvirus in water using bacteria isolated from carp intestines and carp habitats

Since its first outbreak in Japan in 2003, koi‐herpesvirus (KHV) remains a challenge to the carp Cyprinus carpio L. breeding industry. In this study, inactivation of KHV in water from carp habitats (carp habitat water) was investigated with the aim of developing a model for rapidly inactivating the pathogen in aquaculture effluent. Experiments with live fish showed that, in carp habitat water, KHV lost its infectivity within 3 days. Indications were that inactivation of KHV was caused by the antagonistic activity of bacteria (anti‐KHV bacteria) in the water from carp habitats. Carp habitat water and the intestinal contents of carp were therefore screened for anti‐KHV bacteria. Of 581 bacterial isolates, 23 showed anti‐KHV activity. An effluent treatment model for the disinfection of KHV in aquaculture effluent water using anti‐KHV bacteria was developed and evaluated. The model showed a decrease in cumulative mortality and in the number of KHV genome copies in kidney tissue of fish injected with treated effluent compared with a positive control. It is thought that anti‐KHV bacteria isolated from the intestinal contents of carp and from carp habitat water can be used to control KHV outbreaks.     

CCl4对建鲤肝细胞DNA的毒性作用及对CYP3A基因表达的影响

四氯化碳(CCl₄)作为一种经典的肝脏毒物,被广泛应用于哺乳动物的肝损伤模型构建及保肝药物筛选。低、中、高浓度的CCl₄橄榄油溶液(6.25%、12.50%和15.00%,0.01 mL/g)腹腔注射建鲤72 h后,采用单细胞凝胶电泳和肝组织病理切片技术,测定血清中肝损伤生化酶来考察CCl₄对肝细胞DNA的毒性作用;同时采用实时荧光定量PCR法测定肝组织中CYP3A表达量的变化。结果显示,6.25%CCl₄作用建鲤72 h后肝组织切片检查没有发生明显的改变,对血清中酶学指标无显著影响,CYP3A的mRNA表达量与空白对照组相比也没有显著变化,而彗星实验结果显示该浓度的CCl₄作用肝细胞后,尾长、TDNA、尾矩及Olive 尾矩等DNA损伤指标与对照组相比,显著增大;随着CCl₄作用浓度的增加,肝细胞肿胀、广泛空泡变性,出现核固缩和核溶解等组织学的变化,12.50%和15.00% CCl₄均能显著引起血清中谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)水平升高,15.00% CCl₄能显著促进乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)大量生成;彗星实验中各项损伤指标也随着染毒剂量增加而极显著增大;同时,12.50%和15.00% CCl₄组的CYP3A mRNA表达量显著降低。结果表明,CCl₄对建鲤肝细胞DNA具有毒性作用,在实验的浓度范围内,CCl₄ 能抑制CYP3A mRNA表达;随着CCl₄作用浓度的增大,血清酶、病理切片和彗星实验结果表现出剂量效应,并有一定的一致性,彗星实验表现出更高的灵敏性。     

鲤鱼胶原蛋白的过敏原性研究

以鲤鱼鱼皮为研究对象,通过碱溶、酸溶、NaCl盐析等方法从鱼皮中分离纯化得到了胶原蛋白.SDS-PAGE分析显示,鲤鱼胶原蛋白由分子质量约为120 ku和115 ku的2条α链（α1与α2）、分子质量约为250 ku的β链以及大分子质量的γ链组成.分析比较鲤鱼胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的基本性质,结果显示：2种蛋白质的pH值稳定性相似;胶原蛋白的热稳定性不如小清蛋白,但比小清蛋白更耐胃蛋白酶消化;在高温高压处理下,胶原蛋白明显降解,小清蛋白则出现了降解与聚合2种情况.应用8份鱼类过敏患者血清的酶联免疫吸附测定实验结果显示,小清蛋白对6份血清有特异性IgE反应,胶原蛋白对3份血清有特异性IgE反应.Dot-blot实验结果显示,胶原蛋白与鱼类过敏患者血清出现了特异性的杂交显色斑点.与小清蛋白相似,鲤鱼胶原蛋白具有特异的IgE结合活性,提示其是一种潜在的过敏原.     

鲤血浆中阿苯哒唑及其代谢物的HPLC测定方法

[目的]探索用HPLC测定鲤血浆中ABZ及其代谢物的方法。[方法]血浆取自体重为（300±30）g的健康鲤,样品经乙酸乙酯2次提取,探索在1个色谱系统下同时测定鲤血浆中阿苯哒唑及其3种代谢物（亚砜、砜和氨基砜）的方法。[结果]通过考察,确定在测定波长为292nm,流动相为甲醇-冰乙酸-水时,以1．0ml／min的流速经C18柱后4种组分的分离效果最佳,保留时间合适,杂质峰少,且峰形良好。在浓度为0．125～32．000μg/ml的范围内,阿苯哒唑及其3种代谢物平均回收率83．0％～89．2％,日内变异系数2．26％～7．59％,日间变异系数0．45％～2．34％,检测限分别为0．02、0．03、0．05和0．05μg／ml,定量限分别为O．02、0．03、0．05和0．05μg／ml。[结论]建立了利用RP—HPLC同时检测鲤血浆中阿苯哒唑及其3种代谢物的方法。该法操作简单、快速,回收率高,重现性好。