牦牛IGFBP4对肝细胞增殖的调控及功能分析

旨在探究牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4(Bos grunniens insulin-like growth factor binding protein 4, BgIGFBP4)在牦牛肝细胞增殖及小鼠生长中的作用。本研究构建了pET-28a-BgIGFBP4原核表达载体，对其进行表达、鉴定，用终浓度为0.002、0.02、0.2、2、20 μg·mL^-1的BgIGFBP4蛋白处理肝细胞，采用CCK8法、细胞集落形成试验检测BgIGFBP4蛋白对肝细胞增殖能力的影响。再根据试验结果选取浓度蛋白处理肝细胞，检测24、48、72 h时肝细胞活性、肝细胞上清生长类激素和肝细胞PI3K-Akt信号通路的变化。选取30日龄((18±1)g)健康雄性KM小鼠，试验组每2 d灌喂100 μL 50 μg·mL^-1 BgIGFBP4蛋白，对照组用等量0.9%的生理盐水进行灌喂，每组40只，共80只。试验前进行饥饿处理12 h，试验周期为28 d，在试验28 d时检测各项生长性能指标、血清生长类激素水平和肝PI3K-Akt信号通路的变化。结果显示，获得大小约28.86 ku的BgIGFBP4蛋白，并纯化鉴定得到该目的蛋白。2 μg·mL^-1 BgIGFBP4蛋白可促进牦牛肝细胞增殖及集落形成。与对照组相比，试验组(2 μg·mL^-1BgIGFBP4蛋白处理)肝细胞上清GH、VEGF含量显著升高(P<0.05)，肝细胞中PI3K-Akt信号通路细胞增殖相关基因ERBB2、IRS1、PIK3R1、AKT1、RAF1、MAPK3转录水平显著升高(P<0.05)。与对照组相比，试验组(100 μL 50 μg·mL^-1 BgIGFBP4蛋白处理)小鼠平均日增重显著增加、料重比显著降低，肝、脾、肺、肾、小肠器官指数显著增加(P<0.05)。试验组小鼠血清GH、ISN、VEGF含量显著升高(P<0.05)，小鼠肝中PI3K-Akt信号通路相关基因ERBB2、IRS1、PIK3R1、AKT1、RAF1、MAPK3的转录水平显著升高(P<0.05)。综上表明，BgIGFBP4可通过调控PI3K-Akt信号通路促进牦牛肝细胞增殖、并能促进小鼠生长。这为深入研究IGFBP4在牦牛肝生长发育过程中的作用提供了参考。     

芒果苷抗DHAV-1致鸭胚肝细胞炎性损伤的研究

【目的】 探究芒果苷（mangiferin，Man）对鸭甲型肝炎病毒1型（Duck hepatitis A virus-1，DHAV-1）致鸭胚肝细胞（DEHCs）炎性损伤的影响。【方法】 从14日龄SPF级麻鸭鸭胚肝脏组织分离原代DEHCs，用含不同浓度芒果苷（0、5、10、20、40、80和160 μmol/L）的培养液培养48 h后，通过CCK-8法检测其安全浓度范围；用安全浓度的芒果苷培养DEHCs 12、24和48 h后，检测培养液上清中乳酸脱氢酶（LDH）的活力，判定芒果苷对DEHCs的毒性作用。将DEHCs分为对照组（Mock）、模型组（Model）、芒果苷组（Man10、Man20和Man40）和利巴韦林组（Rib），每组3个重复，所有组细胞血清饥饿培养12 h后，Mock组加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，Model、Man10、Man20、Man40和Rib组用DHAV-1（MOI=1.0）攻毒2 h后，Model组更换为含10% FBS的DMEM培养基，Man10、Man20、Man40培养基中分别添加10、20和40 μmol/L芒果苷，Rib组添加1 μmol/L利巴韦林。48 h后收集各组细胞，用比色法检测丙二醛（MDA）含量及过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、总一氧化氮合酶（T-NOS）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性；免疫荧光（IF）法检测DHAV-1在各组DEHCs中的分布情况；Western blotting法检测NLRP3/Pro-Caspase1/IL-1β通路蛋白的表达情况。提取2日龄SPF麻鸭的新鲜全血，分离鸭外周血单个核细胞（duPBMCs），duPBMCs分组及处理同DEHCs，ELISA法检测各组duPBMCs上清液中白介素8（IL-8）和IL-1β的含量。【结果】 与0 μmol/L芒果苷组相比，80和160 μmol/L芒果苷组细胞的增殖能力显著降低（P<0.05），因此5~40 μmol/L芒果苷为处理DEHCs的安全给药浓度。20和40 μmol/L芒果苷处理48 h细胞上清液中LDH活力显著低于处理12和24 h （P<0.05），20和40 μmol/L芒果苷处理12和24 h细胞上清液中LDH活力显著高于5和10 μmol/L芒果苷处理（P<0.05），各浓度芒果苷处理48 h细胞上清液中LDH活力均差异不显著（P>0.05），故48 h为最适处理时间。与Mock组相比，Model组DEHCs中CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活性均显著降低（P<0.05），DEHCs中MDA含量、T-NOS活性、DHAV-1拷贝数、DHAV-1阳性率、NLRP3表达量及duPBMCs中IL-8、IL-1β分泌量均显著升高（P<0.05）。与Model组相比，Man10、Man20和Man40组DEHCs中CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活性均显著提高（P<0.05），DEHCs中MDA含量、T-NOS活性、DHAV-1拷贝数、DHAV-1阳性率、NLRP3表达量及duPBMCs中IL-8、IL-1β分泌量均显著降低（P<0.05）。【结论】 芒果苷可通过增加抗氧化能力、降低DHAV-1的复制水平、抑制NLRP3通路的激活、降低促炎细胞因子的释放抗DHAV-1感染DEHCs造成的炎性损伤。     

JNK抑制剂对仔猪肝细胞药物性损伤的缓解作用及其机理

【目的】 研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125对仔猪原代肝细胞药物性损伤的缓解作用及机理。【方法】 通过二步灌流法获得仔猪原代肝细胞，将肝细胞分为对照组(C)、JNK抑制剂组(SP)、模型组(M)和治疗组(T)，每组6个重复。对照组细胞不添加药物，SP组用2 μmol/L SP600125处理细胞，M组用80 μg/mL脂多糖(LPS)+20 μg/mL恩诺沙星(ENR)处理细胞，T组用80 μg/mL LPS+20 μg/mL ENR +2 μmol/L SP600125处理细胞，处理12 h后，收集上清测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性，收集细胞测定谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及肝细胞核因子-1(hepatocyte nuclear factor 1，HNF-1)和谷胱甘肽-S-转移酶A1(glutathione S-transferase alpha 1，GSTA1)mRNA的相对表达量。【结果】 与对照组相比，M组肝细胞培养液上清中ALT和AST活性均显著升高(P<0.05)，M组肝细胞中GSH-Px和SOD活性、HNF-1和GSTA1 mRNA的相对表达量均极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著提高(P<0.01);与M组相比，T组肝细胞培养液上清中ALT、AST的活性均显著下降(P<0.05)，T组肝细胞中GSH-Px和SOD活性、HNF-1和GSTA1 mRNA的相对表达量均显著提高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。【结论】 JNK抑制剂SP600125可通过调控细胞的抗氧化能力及HNF-1和GSTA1的表达缓解由LPS/ENR导致的仔猪原代肝细胞的药物性损伤。