嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。     

猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×109~8.80×101 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×101 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。     

草鱼呼肠孤病毒生长特性研究

以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)873毒株为试验材料,建立了GCRV荧光定量PCR检测方法;用GCRV873株感染CIK细胞及草鱼,通过对病毒RNA复制水平、子代病毒含量以及细胞病变等情况进行监测,研究其在CIK细胞及草鱼体内的生长特性。在CIK细胞中,GCRV感染后12 h即可检测到子代病毒,36 h时,所有细胞被感染;72 h时,病毒滴度达到最高,为10~(6.75) TCID_(50)/mL。在草鱼的肝、脾、肾中,均能检测到GCRV RNA,其中肾脏中含量最高,其次是肝脏,脾脏中最少。本试验为研究GCRV致病机理及制备细胞灭活疫苗奠定了试验基础。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。     

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)毒株序列设计特异性引物,建立了检测PDCoV的实时荧光PCR方法。该方法在标准品浓度2.49×10~8~2.49×10~2 copies/μL范围内线性关系良好;特异性试验显示,其他几种常见猪病病毒未见典型扩增曲线;敏感性试验显示,最低检测下限为24.9 copies/μL;重复性试验显示,批内和批间变异系数小于3%。用该方法检测62份猪腹泻粪便样品,相比常规PCR方法,前者的检出率更高;两种方法检测1 168份进境活猪粪便拭子样品,结果均为阴性。结果表明,本研究所建立的方法适用于国内猪场的PDCoV的检测和进境活猪的监控检测,也可作为PDCoV的诊断及分子流行病学调查的技术手段。     

钩吻提取物对生长猪生长性能、肠道形态和盲肠菌群的影响北大核心CSCD

本试验旨在研究钩吻提取物对生长猪生长性能、肠道形态和盲肠菌群的影响。选取56日龄生长猪75头,随机分为5组,每组3个重复,每个重复5头。对照组饲喂基础饲粮,钩吻醇提物组分别饲喂在基础饲粮中添加25、50、100 mg/kg钩吻醇提物的试验饲粮,钩吻酸提物组饲喂在基础饲粮中添加150 mg/kg钩吻酸提物的试验饲粮,试验期49 d。结果显示:与对照组相比,饲粮添加钩吻提取物对生长猪的平均日采食量均无显著影响(P>0.05),显著提高了平均日增重(P<0.05),显著降低了料重比(P<0.05),以添加100 mg/kg钩吻醇提物效果最佳;与对照组相比,饲粮添加100 mg/kg钩吻醇提物显著增加了空肠、回肠绒毛高度(P<0.05),显著降低了十二指肠隐窝深度(P<0.05);透射电镜观察结果显示,饲粮添加钩吻提取物使空肠组织微绒毛更加均匀、整齐、致密,相邻细胞间的紧密连接、中间连接和桥粒等结构均结构清晰、完整;与对照组相比,饲粮添加50、100 mg/kg钩吻醇提物显著降低了盲肠中大肠杆菌的数量(P<0.05),显著增加了盲肠中乳酸杆菌的数量(P<0.05)。由此可见,钩吻醇提物和钩吻酸提物均可改善生长猪肠道形态,调整盲肠菌群结构,提高生长猪的平均日增重,降低料重比,以100 mg/kg钩吻醇提物效果最佳。     

育成期太行鸡饲粮代谢能和粗蛋白质适宜水平的研究北大核心CSCD

本试验旨在研究饲粮代谢能和粗蛋白质水平对育成期太行鸡生长性能和血清生化指标的影响,以确定饲粮适宜代谢能和粗蛋白质水平,为制定太行鸡饲养标准提供依据。以代谢能(11.0、11.5、12.0 MJ/kg)和粗蛋白质水平(14%、15%、16%)为因子,采用2因素3水平的试验设计。选取体重均匀、健康的77日龄太行鸡母鸡360只,随机分为9组,每组设4个重复,每个重复10只鸡。预试期3 d,正试期42 d。结果表明:1)饲粮代谢能水平对育成期太行鸡平均日采食量和料重比的影响显著(P<0.05),随饲粮代谢能水平的升高,育成期太行鸡的平均日采食量和料重比降低。饲粮粗蛋白质水平对育成期太行鸡料重比的影响显著(P<0.05),随饲粮粗蛋白质水平的升高,育成期太行鸡的平均日采食量先增加后降低,料重比先减小后增大。饲粮代谢能和粗蛋白质水平对育成期太行鸡平均日采食量、平均日增重和料重比表现出显著互作效应(P<0.05)。2)饲粮代谢能水平对育成期太行鸡平均日代谢能摄入量(ADMEI)和平均日粗蛋白质摄入量(ADCPI)的影响显著(P<0.05),随饲粮代谢能水平的升高,育成期太行鸡的ADMEI增加。饲粮粗蛋白质水平对育成期太行鸡ADCPI的影响显著(P<0.05),随饲粮粗蛋白质水平的升高,育成期太行鸡的ADCPI增加。饲粮代谢能和粗蛋白质水平对育成期太行鸡ADMEI和ADCPI表现出显著互作效应(P<0.05)。3)饲粮代谢能水平对育成期太行鸡血清甘油三酯含量的影响显著(P<0.05)。饲粮代谢能和粗蛋白质水平对育成期太行鸡血清甘油三酯含量表现出显著互作效应(P<0.05)。综合血清生化指标得出,饲粮代谢能水平为11.5 MJ/kg即可以满足太行鸡的能量需要。综合考虑各项指标,育成期太行鸡饲粮适宜代谢能水平为11.5 MJ/kg,适宜粗蛋白质水平为14%~15%。     

谷氨酰胺对夏季水貂生长性能、血清生化指标和抗氧化能力的影响北大核心CSCD

本试验旨在研究饲粮中添加不同水平的谷氨酰胺(Gln)对夏季水貂生长性能、血清生化指标及抗氧化能力的影响。选取育成期水貂160只,随机分为5组,每组32只(16只公貂,16只母貂),水貂单笼饲养。对照组水貂饲喂不添加Gln的基础饲粮,试验组水貂分别饲喂在基础饲粮基础上添加0.2%、0.4%、0.6%和0.8%Gln的试验饲粮。试验期8周。结果表明:饲粮中添加0.4%和0.6%的Gln可显著提高母貂的平均日采食量(P<0.05);饲粮中添加0.4%的Gln可极显著提高水貂的平均日增重(P<0.01),并显著降低水貂的料重比(P<0.05)。饲粮中添加Gln对水貂血清葡萄糖含量和肌酸激酶活性无显著影响(P>0.05),但添加0.4%和0.6%的Gln可显著提高血清总蛋白含量(P<0.05),显著降低血清尿素氮含量(P<0.05)。饲粮中添加0.2%和0.4%的Gln可显著提高水貂血清抑制羟自由基能力(P<0.05),但对血清抗超氧阴离子能力无显著影响(P>0.05);饲粮中添加0.4%和0.6%的Gln可显著降低水貂血清丙二醛含量(P<0.05),极显著提高血清总抗氧化能力(P<0.01),显著提高血清谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.05)。综合各项指标,夏季高温条件下,育成期水貂饲粮中Gln的适宜添加水平为0.4%。     

饲料组胺水平对黄颡鱼生长性能、血清生化指标和胃肠道黏膜结构的影响北大核心CSCD

本试验旨在研究饲料组胺水平对黄颡鱼生长性能、血清生化指标和胃肠道黏膜结构的影响。以初均重为(30.08±0.35)g的黄颡鱼为试验对象,分别投喂金枪鱼鱼粉饲料(TFM组)、白鱼粉饲料(H0组,作为对照组)以及白鱼粉饲料中分别添加5个水平组胺的试验饲料(H1、H2、H3、H4和H5组),各组饲料组胺水平分别为53.20、4.30、18.00、56.20、84.60、103.50、158.90 mg/kg。试验期60 d。结果显示:1)H1组黄颡鱼的末均重、特定生长率显著高于H0、H2、H3和H4组(P<0.05)。黄颡鱼生长速度与饲料组胺水平显示出二次函数关系的变化趋势。TFM、H3、H4和H5组黄颡鱼的存活率显著低于H0、H1和H2组(P<0.05)。2)H0组黄颡鱼的总胆汁酸含量显著高于其他各组(P<0.05)。各组黄颡鱼体侧皮肤类胡萝卜素和叶黄素含量没有显著差异(P>0.05)。3)通过对黄颡鱼胃黏膜的扫描电镜观察以及肠道黏膜细胞间连接结构的透射电镜观察发现,饲料低水平组胺对黄颡鱼的胃黏膜、肠道紧密连接未造成显著损伤,饲料组胺水平达103.50 mg/kg及以上对黄颡鱼的胃黏膜、肠道黏膜细胞之间的紧密连接结构造成了严重的损伤。由此可见,饲料组胺水平为18.0 mg/kg时对黄颡鱼生长和鱼体健康是有利的,而饲料组胺水平大于103.50 mg/kg时对黄颡鱼的生理健康、胃黏膜细胞表面结构和肠道黏膜细胞之间的紧密连接结构有较为明显的损伤作用。     

X射线荧光光谱法快速测定稻谷中的镉

探索了一种对稻谷中重金属镉的快速、直接的测定方法,以适用稻谷集中收购、存储和流通过程中快速检测的的需要。样品无需前处理,直接磨成粉状即可上机测定。该方法采用X射线荧光光谱分析的原理,样品中的待测元素受激产生特征X射线,并由高性能探测器接收,得到镉元素的信号强度,然后根据信号强度与浓度的比例关系,经过软件处理自动计算样品中镉的含量,20min内完成精确定量。检出限可达到0.034mg/kg,实物标样标准偏差为0.016。此方法简单快速,并且准确性高,重现性好,可广泛应用于稻谷中镉的快速检测。