猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒(PoRV)在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3%胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;一步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈"S型"曲线增长,感染后0⁸h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;88h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8³6h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3%是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪轮状病毒四川株的分离鉴定及增殖规律

为了解猪轮状病毒（PoRV）在MARC-145细胞系上的培养特性及增殖规律,本试验利用MARC-145细胞,从四川仔猪腹泻样品中分离到1株PoRV,并通过PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实,命名为SC-R株。用含不同浓度胰酶营养液培养SC-R株48h后,分别收集病毒液进行定量分析;同时,以SC-R分离株感染MARC-145细胞,在感染后不同时间分别收集感染病毒液,利用PoRV荧光定量检测方法对不同样品中病毒RNA进行定量分析,绘制PoRV生长曲线。结果表明,用含3％胰酶营养液培养的细胞液中PoRV的RNA含量明显高于其他组;-步生长曲线显示细胞外病毒RNA含量呈“s型”曲线增长,感染后0～8h为潜伏期,病毒RNA含量维持在较低水平;8～36h为突破期,病毒RNA含量呈对数增长;感染48h增长速度减缓,维持在较高水平,逐步进入稳定期。胰酶可增加PoRV对细胞的感染性,3％是本试验最为适用的胰酶浓度;PoRV感染MARC-145后在细胞内增殖并逐步释到细胞外。     

猪细小病毒在PK细胞中的增殖过程

将猪细小病毒南京毒株1（NJ-1）、南京毒株2（NJ-2）和7909毒株接种于PK-15细胞，用免疫荧光检测方法研究了猪细小病毒增殖的基本特性与规律。在PK-15细胞中，3个毒株的增殖规律基本相似，均在感染后12h即可检测到荧光，表明其子代病毒粒子产生，随后逐渐增多，在感染后48h荧光几乎遍布所有细胞，随后荧光开始衰减，在84h时病毒引起细胞大面积崩解，荧光呈现岛屿状分布。通过绘制其一步法生长曲线可知，在病毒感染后12h，细胞培养液中的病毒TCID50／ml。为2．0左右，随后逐渐增高，感染后60h3种毒株的TCID50／mL均达到最高，子代病毒粒子向细胞外释放也达到高峰，其后TCID50逐渐下降。培养液中病毒粒子的丰寿期为7h。     

应激活化蛋白激酶在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染和调节病毒诱导的细胞因子生产中的作用研究

试验旨在研究p38 MAPK和JNK通路在繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)中的作用。感染PRRSV后36 h,p38和JUK1/2逐渐被激活;感染后48 h,其磷酸化水平显著降低至基线。然而紫外线灭活的PRRSV不能引起这些应激活化蛋白激酶(SAPKs)的磷酸化,表明病毒侵入后的步骤才能激活这些激酶。单独用p38或JNK抑制剂处理,都能显著降低PRRSV的感染,导致病毒基因组和亚基因组RNA合成、病毒蛋白表达、子代病毒生产的显著降低。并且抑制SAPKs时,感染PRRSV的PAM细胞中细胞因子的产生会发生改变。本研究结果表明,p38和JNK信号通路在病毒复制中发挥关键作用,并可能在病毒感染时调节免疫应答。     

小分子药物索非布韦对牛病毒性腹泻病毒体外复制的影响

试验旨在研究小分子药物索非布韦是否具有抑制牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）复制的作用。通过MTT法测定了不同时间和不同浓度索非布韦对牛肾细胞（MDBK）增殖的影响;采用免疫荧光染色试验筛选出能有效抑制BVDV复制的索非布韦最适浓度,用实时荧光定量PCR、致细胞病变作用（CPE）和病毒半数组织细胞感染量（TCID₅₀）测定的方法检测索非布韦对BVDV复制的影响。结果显示,索非布韦处理MDBK细胞24和48 h能极显著抑制细胞增殖（P<0.01）;与对照组相比,当索非布韦浓度为800 μmol/L时免疫荧光染色检测BVDV感染MDBK细胞的双链RNA（dsRNA）含量极显著降低（P<0.01）;实时荧光定量PCR检测发现,与DMSO处理组相比,BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞,BVDV 5'UTR mRNA含量在病毒感染24和48 h时极显著降低（P<0.01）;BVDV感染索非布韦处理组MDBK细胞病变现象明显减弱;索非布韦处理24 h后能极显著减弱BVDV感染MDBK细胞后子代病毒颗粒的形成组与释放（P<0.01）,降低病毒滴度。综合上述结果表明,小分子药物索非布韦能有效抑制BVDV体外复制。     

RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立

为了直观、高效、特异性地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞和组织中PRRSV RNA,本研究根据HP-PRRSV Hu N4株ORF7基因序列设计8对28 bp~36 bp双"Z"结构的寡核苷酸探针(PRRSV-Nprobes),建立了一种新的PRRSV RNA原位杂交检测的方法。该方法能特异性的检测PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中PRRSV RNA,而对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)感染PAMs中的核酸呈现阴性。应用该方法检测PRRSV感染仔猪肺脏、腹股沟淋巴结和胸腺石蜡包埋组织切片中PRRSV RNA,在感染的腹股沟淋巴结中PRRSV RNA呈现集中分布,而PRRSV RNA在肺脏和胸腺中呈弥漫性分布。该方法可用于细胞和组织中核酸的定位及分布规律的研究,特别是用于病毒含量较少的潜伏感染的检测,为PRRSV实验室检测和致病机理研究奠定了良好的试验基础和技术支持。     

犬细小病毒四川株的分离鉴定与一步生长曲线的测定

为研究犬细小病毒(CPV)生长规律,利用F81细胞从四川地区疑似CPV感染的病犬血样粪便中分离得到1株CPV,对该株病毒进行理化试验、微量中和试验、PCR鉴定以及分子生物学系统鉴定后,证实该分离株是CPV,命名为SC-C。以SC-C分离株感染F81细胞,感染后不同时间收取上清,利用CPV荧光定量PCR检测方法对不同样品中病毒DNA进行定量分析,绘制CPV一步生长曲线。结果显示,感染后,0⁸h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,128h细胞内病毒DNA含量较低,感染8h后,细胞内病毒DNA含量逐渐增长,12⁶0h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后060h细胞内病毒DNA含量迅速增长,60h后细胞内病毒DNA含量变化不大。CPV感染F81细胞,感染后0¹2h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;1212h为潜伏期,病毒DNA含量维持在较低水平;12⁶0h为突破期,病毒DNA含量呈对数增长;感染60h后增长速度减缓,病毒含量维持在较高水平逐步进入稳定期,病毒DNA含量呈"S型"曲线增长。     

天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究

为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制，本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后，采用MTT法检测BBM对MDBK细胞的影响，结果显示，与对照浓度相比，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L BBM对细胞增殖抑制作用均较小(P>0.05)。因此选择上述3种浓度的BBM分别处理MDBK 12 h后以103TCID50BEV感染，24 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测BEV双链RNA (dsRNA)，以确定BBM对BEV的最佳抑制浓度。MDBK细胞经10μmol/L BBM处理后感染BEV，观察48 h内BEV致细胞病变效应(CPE)，采用荧光定量PCR检测BEV 5’UTR m RNA转录水平及测定子代病毒滴度，以确定BBM体外对BEV的抑制效果。IFA结果显示，与对照组相比，10μmol/L BBM对BEV ds RNA具有极显著性抑制作用(P<0.01)；细胞形态观察结果显示，BBM对BEV引起的细胞大面积脱落具有一定的抑制效果；荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，在感染48 h的细胞中BEV 5’UTR m...     

猪瘟活疫苗效力检验替代方法的研究

目前,我国猪瘟活疫苗效力检验最常用的方法是测定猪瘟疫苗中病毒的兔体感染量(RID),但是用该方法易受到检验兔品种、个体和饲养环境的影响。为了探索一种不依赖动物的疫苗效力检验新方法,本研究将待检猪瘟活疫苗系列稀释后分别接种易感细胞,使用抗原捕获ELISA、RT-nest PCR和RT-PCR三种方法检测不同稀释度疫苗中活病毒在感染细胞后增殖的子代病毒,计算疫苗病毒的最高细胞感染剂量,建立了猪瘟疫苗病毒的细胞感染量(CID)的效力检验方法。结果显示:疫苗中活病毒粒子越多,CID就越高;对不同类型猪瘟疫苗的检测结果表明,该方法适用于传代细胞源和细胞源猪瘟活疫苗的效力效检。使用CID和RID两种检测方法同时对12批猪睾丸传代细胞源(传代细胞源)和3批牛睾丸原代细胞源(细胞源)猪瘟活疫苗进行了比对效检,结果表明,用CID测定方法检验,12批猪瘟活疫苗(传代细胞源)每头份均含105CID,3批猪瘟活疫苗(细胞源)每头份含量均为104CID;用兔子感染体温测定法,12批猪瘟活疫苗(传代细胞源)每头份含量在2.6×104~3.0×104RID之间,3批猪瘟活疫苗(细胞源)每头份含7.0×103~8.0×103RID。试验证明:本实验室建立的CID检测结果与现有质量标准RID的结果存在良好的相关性,能够较好反映疫苗中活病毒的含量,有望成为RID的替代方法。     

G2系和G5系鸡感染马立克氏病毒早期细胞因子转录水平的变化

为研究主要组织相容性抗原(MHC)不同的G2系和G5系鸡在感染马立克氏病毒(MDV)后立即早期病毒复制及细胞因子转录水平的动态变化,本实验对14日龄G2和G5系SPF鸡滴鼻接种超强毒(vv MDV)Md5株,以28S r RNA基因为内参,利用双重荧光定量RT-PCR(dq RT-PCR)方法对接种后4 h、24 h、48 h和96 h肺淋巴细胞、脾脏和外周血淋巴细胞(PBL)中MDV meq、IFN-γ、IL-18、IL-4和IL-10的m RNA含量进行检测。结果显示,接种后96 h仅在两品系感染鸡的肺淋巴细胞和脾脏中检测到了meq m RNA,G2系鸡群肺淋巴细胞中病毒m RNA含量高于G5系,但脾脏中较低。96 h肺淋巴细胞和脾脏中IFN-γ、IL-4和IL-10转录水平大幅上调,并且G2系鸡群均略高于G5。本研究结果提示G2系对MDV的抵抗能力强于G5,这两种品系鸡感染MDV后可能主要启动以Th2型为主的细胞免疫反应,为研究MDV对不同MHC单倍型鸡的致病性提供了实验依据。