α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

禽源大肠杆菌耐药性研究进展

禽大肠杆菌病是由大肠杆菌所引起的局部或全身性感染的疾病,其病原抗原性复杂,血清型多样,临床症状和病理变化多变,且多与病毒性疾病和其他细菌性疾病并发,给养禽业生产带来重大损失.     

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列（NC006233）设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析酣蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa-483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a（＋）中,转化BL21（DE3）菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65．2ku的重组蛋白,命名为卜出,表达量占菌体蛋白总量的60．8％;Westernblot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。     

产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价

对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56和130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcpam4。将Gcpam4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPAm4。利用Western blot方法检测rCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测纯化蛋白的毒力。随后,将rCPAm4与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例混合乳化制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后21d,对家兔通过耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rCPAm4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清反应;小鼠安全性试验显示,5.5mg/kg剂量的rCPAm4对小鼠仍无致死性;免疫rCPAm4后,每毫升的一免抗血清可中和10～20个小鼠MLD、二免抗血清可中和30～50个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%死亡,免疫组家兔得到了100%的保护。以上结果表明,rCPAm4具有良好的安全性和免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

猪伪狂犬病毒gE基因在大肠杆菌中的表达

根据Genebank中伪狂犬病毒Min-A株gE基因序列,设计了一对引物,PCR扩增长度为557bp的gE基因去信号肽后的主要抗原区域(157-714bp),将其克隆进测序载体PGEM-Teasy中,成功构建质粒PGEMTeasy-gE。用BamhI和HindIII将gE基因主要抗原区域从PGEM-Teasy中切出,然后与同样酶处理的原核表达载体PET32A连接,命名为PET-gE。在IPTG的诱导后,经SDS-PAGE电泳发现43ku处出现特异性蛋白条带。经过Western blot分析,表达产物具有很好的免疫原性。该研究成功表达出具有抗原性的目的蛋白,为血清学鉴别诊断方法gE-ELISA的建立打下很好的基础,同时gE-ELISA也能对野毒和疫苗毒进行鉴别。     

刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。     

人乳头瘤病毒16L1蛋白的原核表达及免疫原性研究

采用聚合酶链反应技术从宫颈癌组织中获得人乳头瘤病毒(HPV)16L1基因,克隆到pGEM—TEasy载体中,再连接到原核表达载体pGEX-6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、SDS—PAGE分析,用表达产物免疫小鼠,获得的血清进行间接免疫荧光检测。结果表明：获得的pGEX-6p-1-L1基因在大肠杆菌中能以谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的形式得到高效表达,表达产物免疫小鼠,间接免疫荧光显示免疫血清能与peDNA—L1转染的B16细胞呈现特异反应,说明体外表达的HPV16L1蛋白保留了天然蛋白的抗原性,可作为HPV的诊断抗原、免疫学分析和疫苗研制的原料。     

从许氏平鲉体表分离海分枝杆菌的鉴定及其脂多糖的抗原性分析

从许氏平鲉粘液、背鳍、鳃等部位分离筛选到同一菌株FZ09,经形态学观察、生理生化特性及热激蛋白65(HSP65)基因序列分析,鉴定菌株FZ09为海分枝杆菌。分别用酚-氯仿-甲醇法、乙醇-酚水法和传统热酚水法提取菌株FZ09的脂多糖(LPS),分析了LPS的组成和抗原性差异。SDS-PAGE结果表明,3种方法提取的LPS条带分布基本相同,主要条带分子量分别为14、16和23 ku,其中以乙醇-酚水法提取的LPS含量和纯度最高,热酚水法提取的LPS条带最多,抗原性最好。Western-blotting显示,海分枝杆菌抗血清主要与LPS的14 ku条带发生特异性免疫反应。高碘酸氧化免疫印迹结果表明,仅传统热酚水法提取的LPS在14 ku分子量区域有弱的阳性条带出现,其他方法提取LPS与抗血清的免疫反应呈阴性。高碘酸氧化ELISA反应显示,LPS经高碘酸氧化后与海分枝杆菌FZ09抗血清的反应活性降低,OD₄₀₅明显减弱。     

鸡柔嫩艾美耳球虫2种假定致密颗粒蛋白基因的克隆与表达

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种严重危害养鸡业健康发展的高致病性原虫,致密颗粒蛋白(dense granule proteins, GRAs)是顶复合器门原虫胞内寄生重要功能蛋白,具有较高的免疫学应用价值,然而目前尚未有关于球虫致密颗粒蛋白的确切报道。为发掘柔嫩艾美耳球虫GRAs并研究其功能,采用生物信息学、分子生物学、免疫学等技术从E.tenella北京株中鉴定到2种假定致密颗粒蛋白(hypothetical dense granule protein, hEtGRA)hEtGRA12、hEtGRA9,并用纯化后的蛋白分别免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA、Western blot方法检测2种蛋白的抗原性。分子克隆结果表明,hEtGRA12、hEtGRA9基因编码区长度分别为1 188、1 110 bp,分别编码395、369个氨基酸,与其他顶复合器门原虫致密颗粒蛋白GRA12、GRA9物种间相似性分别为28.8%～39.6%、27.5%～29.5%;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9条带大小分别为63.6、67.0 ku;...     

牙鲆秦皇岛弧菌HQ010712-1外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)和苯甲基磺酰氟(PMSF)2种方法提取秦皇岛弧菌HQ010712-1(Vibrio qinhuangdaora sp.nov.)外膜蛋白,结果显示 Sarkosyl法提取效果较好,且所提取的主要外膜蛋白分子量为102kD、45 kD、39 kD、36 kD、30 kD、28 kD、24 kD、22 kD;为比较该菌株与弧菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)为对照,电泳图谱显示4种弧菌外膜蛋白的分子量主要集中在22～48 kD之间;利用抗秦皇岛弧菌HQ010712-1血清的免疫印迹表明菌株HQ010712-1外膜蛋白中分子量为45 kD、36 kD的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种弧菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为36 kD的反应带为菌株HQ010712-1、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌共有.本研究旨在为进一步筛选和研究致病性弧菌的共同保护性抗原提供参考.