人α-防御素-3基因乳腺特异性表达载体的构建及在兔乳腺中的瞬时表达

为探索人α-防御素-3(HNP-3)基因在兔乳腺中特异性表达的可行性,将HNP-3基因与大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5'端调控区序列融合,定向克隆到PEGFP-1表达载体EGFP基因上游,在EGFP基因3'端加上His标签蛋白基因序列,构建了HNP-3基因乳腺定位表达载体pEGFP-WAP-HNP-S,将pEGFP-WAP-HNP-S与脂质体包裹后通过乳腺导管注射法转入妊娠母兔乳腺中,Western blot和ELISA检测HNP-3融合基因在乳腺中表达和融合蛋白的表达水平,并用Ni亲和层析柱进行纯化.结果表明:分娩后初乳中即有分子质量为40 kD的HNP-3融合蛋白表达,分娩后第4 d达到高峰,表达量为2 65 ng/mL.实验证明HNP-3融合基因在乳腺组织中能够特异性的表达.     

长白猪甘露聚糖结合凝集素的分离纯化

对猪血清用PEG-6000进行预处理后,用甘露聚糖结合凝集素-Sepharose4B亲和柱亲和层析,获得纯化的猪MBL样品.然后进行还原性的10%SDS-PAGE电泳,测定分子量与纯度.得到纯化的猪血清MBL分子有3种单体,分子量分别为33kDa、36kDa和56kDa.表明猪血清中MBL是以多聚体形式存在,而且具有糖基化位点.本研究为进一步研究猪MBL的生物学特性提供了基础.     

应用一步亲和层析法纯化转基因山羊乳腺定位表达的组织型纤维蛋 …

对转基因山羊乳腺定位表达的羊奶中组织型纤维蛋白溶酶原激活剂（ｔＰＡ）的分离纯化方法作了研究，摸索出一种简单可行的纯化方法。羊奶中ｔＰＡ先经冰乙酸和丙酮沉淀后，再通过Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ柱一步亲和层析，纯化倍数达６７１４．３倍，比活性１８８０００Ｕ／ｍｇ，活性回收率２６％。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ还原电泳分析，ｔＰＡ纯度大于９５％，其中低分子双链蛋白占９０％以上；Ｗｅｓｔｅｒｎ－     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白C端片段的克隆及原核表达

[目的]为进一步研制检测乙脑抗体试剂盒奠定了基础。[方法]以本实验室已构建的重组质粒pET-E(E为乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白)为模板,利用PCR扩增乙型脑炎病毒E蛋白基因3′端部分片段,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析表达产物。[结果]所表达的融合蛋白分子量约为38KD,表达产物以水溶形式存在,37℃,诱导4 h的诱导培养条件最佳,表达量约占茵体总蛋白的20?。表达产物经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。ELISA检测表明,表达的蛋白能与猪乙脑病毒抗体血清发生特异性反应,具有很好的抗原性。[结论]基因工程表达的JEV E蛋白有望成为重要的实验室诊断抗原。     

大豆蛋白偶联壳聚糖微球介质提取纳豆激酶的研究

采用液体反相悬浮法制取壳聚糖微球,在微球表面偶联纳豆激酶的亲和配体一大豆蛋白,作为纳豆溶栓酶的亲和吸附介质.结果表明:壳聚糖微球本身对纳豆激酶没有特异吸附,偶联大豆蛋白的壳聚糖微球对发酵粗酶液中的纳豆激酶的吸附性能符合Langmuir方程,吸附平衡时间约为60 min,最大吸附量为3 926.56 U·8-1.纳豆激酶...     

猪肺抑肽酶分离纯化及部分性质分析

以新鲜猪肺为材料,Sepharose4B偶联胰蛋白酶作为亲和层析介质,从猪肺中分离纯化高比活猪肺抑肽酶。结果表明,猪肺的抑肽酶含量为1.86mg/kg,酶比活力达4593U/mg;猪肺抑肽酶耐热性好、对pH敏感性低,在280nm处有最大光吸收,对胰蛋白酶有很强的抑制作用。     

双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备

纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。     

牛白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将编码牛白细胞介素-2(BoIL2)成熟肽的cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB中，构建出含BoIL2基因的重组质粒BoIL2-pPICZB。将经Sac Ⅰ酶切后线性化的BoIL2-pPICZB电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，转化子经高浓度Zeoein抗性筛选鉴定后，用1％甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE及Western blotting检测，表明BoIL2在酵母中获得了胞内表达；通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的重组蛋白；培养小鼠CTLL2细胞进行活性检测，证实所表达的重组BoIL2具有生物活性。