真核表达载体pCDNA3-CaBP-D28k的构建及细胞表达

构建钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)真核表达载体,并证实了其在真核细胞COS-1中的表达情况,为进一步研究该重组载体在动物体内的表达奠定了基础。通过酶切方法自含鸡CaBP-D28k基因的克隆质粒pGEM-T-CaBP-D28k中扩增CaBP-D28k基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CaBP-D28k在COS-1中的表达。     

Species diversity of thrips (Thysanoptera) in selected avocado orchards from Mexico based on morphology and molecular data

Avocado is one of the most important crops in the world, and Mexico is the largest producer of this fruit. Several insect pests affect its production, and thrips are amongst the most important. A key step in the design of control methods is accurate species identification. Despite this, formal reports on species diversity of thrips in Mexico are very scarce. Morphological identification can sometimes be time-consuming and inconclusive. Therefore, we explored the species diversity of thrips in Mexican avocado orchards(Michoacan state) based on partial sequences of the mitochondrial gene cytochrome oxidase subunit Ⅰ(COⅠ). Forty-four specimens were analysed, which represented approximately 8% of all individuals collected from five localities distributed in three Municipalities. All specimens were analysed using the COⅠ marker, and specimens within the genera Frankliniella were also analysed using a marker within the D2 domain of the 28 S(28 SD2) nuclear ribosomal DNA. Molecular identifications were confirmed using morphological taxonomy. Overall, six genera were found(Neohydatothrips, Scirtothrips, Frankliniella, Arorathrips, Caliothrips and Leptothrips). All genera contained only one species, except Frankliniella, for which there were six species. Data from the two molecular markers suggest the existence of cryptic species within Mexican F. occidentalis populations.     

白斑综合征病毒(WSSV)基因VP28原核表达与检测

VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白.将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、Xho Ⅰ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到pET-28a(+)表达载体上.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体pET-28a-VP28.转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达.采用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了纯度为95％的大肠杆菌重组蛋白VP28.该纯化蛋白作为绝对定量Western的标准品,梯度稀释建立标准曲线,以定量检测转基因鱼腥藻7120中的VP28绝对表达量.实验结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白VP28与鱼腥藻7120中表达的VP28分子量基本相同,纯化后的大肠杆菌重组蛋白梯度稀释作为绝对定量Western标准曲线,计算出转基因鱼腥藻7120在培养第17天时,VP28的表达量最大,为5.14 μg/mL,占转基因鱼腥藻7120总蛋白浓度的1.45％.这不仅对转基因鱼腥藻的高效培养具有重要意义,也为日后确定投喂对虾口服疫苗有效剂量防治白斑综合征奠定了基础.     

基于核糖体28S rRNA对叶螨的鉴定及其系统发育分析

通过研究核糖体28SrRNA的D1～D2部分序列来阐述蜱螨亚纲叶螨科6个属11个物种的系统发生关系。研究结果证实了形态学上定义的叶螨属(Tetranychus)、全爪螨属(Panonychus)、双叶螨属(Amphitetranychus)、裂爪螨属(Schizotetranychus)、缺爪螨属(Aponychus)和岩螨属(Petrobia)等6个属分别形成一个单系,然而在叶螨属内截形叶螨(T.truncatus)、土耳其斯坦叶螨(T.turkestani)、神泽叶螨(T.kanzawai)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus)和二斑叶螨(T.urticae),及全爪螨属内苹果全爪螨(Pa.ulmi)和柑橘全爪螨(Pa.citri)各物种的系统发生地位并没有被很好地确定。因此,基于核糖体28SrRNA序列无法将叶螨鉴定到种水平,但却为属水平上的鉴定提供了重要的参考。     

对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白激酶wsv083的初步研究

为探讨VP19和VP28是否由蛋白激酶wsv083催化发生磷酸化,将wsv083、VP19和VP28分别进行原核表达。将wsv083蛋白、wsv083表达菌株的裂解液上清以及去磷酸化的wsv083蛋白分别和2种膜蛋白相互作用,以及将wsv083、VP19和VP28的表达质粒共转化至同一菌株中进行表达。结果均未能发现VP19和VP28被磷酸化,但发现wsv083蛋白自身具有苏氨酸和酪氨酸磷酸化的现象。改变wsv083表达质粒,wsv083蛋白同样出现了磷酸化现象。而在将wsv083的序列改变使其失去激酶活性后,表达出的wsv083蛋白不再具有磷酸化的现象。因此认为VP19和VP28的磷酸化不是由wsv083催化产生,wsv083能够自我磷酸化。     

VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析

为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%.     

特高糖抗寒甘蔗新品种桂糖28的选育

为培育高产、高糖、多抗的甘蔗新品种,不断满足糖料生产发展的需要,2000～2008年,采用“五圃制”的常规杂交育种的技术路线进行选择与培育．育成了特高糖高产抗旱抗寒的甘蔗新品种桂糖28。桂糖28（原名桂糖00—122）,其亲系为CP80—1018×CP88—2032。该品种中至中大茎。特早熟、特高糖、高产、宿根性好,抗逆性强,适应性广,极易脱叶。甘蔗蔗糖分（16．60％）较ROC16（15．07％）高1．53％,最高甘蔗蔗糖分达19．19％;产蔗量（86．2t／h秆）较RoC16（83．1t／hm^2）增产3．73％,最高产蔗量达159．2t／hm^2;含糖量（14．31t／hm^2）较ROC16（12．52t／hm^2）增产1430％。适应于广西、云南、广东、福建等省蔗区种植。桂糖28的育成是广西甘蔗高糖育种取得的突破性进展,对丰富我国甘蔗品种材料．改良目前甘蔗单一化的品种结构具有重要现实意义。     

基于28S rDNA分析板栗和杉木上针叶小爪螨物种分化原因

【目的】我国经济林树种板栗和杉木上的重要害螨一直被认为是同一种螨——针叶小爪螨,但针叶小爪螨的山东板栗种群和浙江杉木种群间存在生殖隔离,且生殖隔离并非由地理隔离和能调控寄主生殖的内共生菌引起,似乎二者已分化为2个独立的种。本研究目的是明确其成种原因,丰富物种形成理论。【方法】从之前做杂交试验时所采集的针叶小爪螨板栗和杉木种群中各随机取3头雌成螨,提取单头雌成螨的总DNA,使用根据其他小爪螨28S rDNA两端保守序列设计的引物扩增28S rDNA,扩增产物纯化后测序。比较2种群的28S rDNA序列,并基于28S rDNA序列构建小爪螨属系统发育树,结合已有研究分析两种群分化原因。【结果】每个种群的3个个体的28S rDNA序列完全一致,无种群内变异。2种群的28S rDNA序列一致性为98. 3%,遗传距离为1. 7%。在基于28S rDNA序列构建的小爪螨属系统发育树上,浙江杉木种群与采自日本的日本柳杉上的本岛小爪螨亲缘关系最近,山东板栗种群与采自日本的日本栗上的栗小爪螨的亲缘关系最近。【结论】板栗和杉木上的叶螨并非由同一种叶螨因适应不同寄主植物分化而成,很可能是2个独立的物种。     

河北省长针线虫新纪录种松长针线虫Longidorus pinus Xu,Ye,Wang & Zhao的形态与分子鉴定

2018年,在河北省保定市园林植物紫荆(Cercis chinensis)根围分离到一种长针线虫。经形态学观察和28S rDNA D2D3区序列分析,将其鉴定为松长针线虫(Longidorus pinus Xu, Ye, Wang&Zhao)。其雌虫主要形态特征为:雌虫体长3 048～3 464μm,唇区明显缢缩,宽9.5～10.5μm,侧器囊袋状,齿尖针长66.0～69.5μm,导环距体前端27.5～30.0μm,尾长31～33μm,短圆锥形,尾长与肛门处体宽比值=1.5～1.6。松长针线虫河北种群28S rDNA D2D3区与GenBank数据库的山西种群进行序列比对,相似性为99.2%～99.9%。松长针线虫是河北省长针线虫新纪录种。紫荆是松长针线虫的新寄主。     

拟南芥质膜水通道蛋白RD28保守区段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备

实验利用ＰＣＲ技术,从拟南芥原膜水旧白ＲＤ２８的ｃＤＮＡ中扩增了所有植物细胞质膜水通道蛋白保守区段（４２０ｂｐ）,并将其构入ｐＧＥＸ－ＫＧ。酶切、测序分析表明重组质粒ｐＧＥＸ－ＲＤ２８结构正确。０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ可诱导表达分子量约４０ｋＤ融合蛋白ＧＳＴ－ＲＤ２８,该蛋白主要以非包涵体的形式存在。诱导表达后的菌体超声裂解液经谷胱甘肽活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和层析柱纯化得到了高纯度Ｇ