猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板，对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒，经DNA测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e，成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒，进行EcoR Ⅰ和Sα／Ⅰ双酶切，获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。提取质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确，从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，证明其分子质量约为29ku；Western-blotting分析表明，该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别，具有生物学活性。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物，用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架(ORF)后克隆至表达载体pET-32a( )，构建了重组表达质粒pET-32a( )-cSZ1，并将其转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经IPTG诱导，获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达，表达产物量可达菌体总蛋白的9．3％，融合蛋白的分子质量约为40ku。重组菌诱导表达的产物经SDS—PAGE后，用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析，结果为阴性，提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因（vgb）克隆到融合表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21（DE3）表达。重组蛋白在30℃诱导获得可溶表达。利用Ni^2＋亲和层析对重组蛋白进行了纯化，得到重组的透明颠菌血红蛋白，蛋白呈红色。实验现象显示重组蛋白与血红索相结合。紫外光区和可见光区波长扫描分析显示：蛋白粗提物和纯化后的血红蛋白在230nm和413nm都有强吸收峰，初步表明，尽管重组蛋白比天然蛋白多36个氨基酸，重组蛋白仍然具有生理活性。诱导后4h和6h的培养液氨基乙酰丙酸含量分别达到17mg／L和21mg／L。说明重组蛋白的表达明显促进了体内heme合成途径。     

蓝塘仔猪IGF-1水平与组织IGF-1、GHR基因的表达

32头不同日龄(出生、3、21、35d)蓝塘仔猪,由前腔静脉采血后剖杀,取肝脏、背最长肌样品。用RIA法测血液、组织中IGF 1浓度,用放射受体法(RBA)检测肝脏、肌肉组织中GHR结合活性,用实时荧光定量PCR法检测IGF 1、GHRmRNA的表达水平。结果表明:(1)血液中IGF 1在出生日显著高于其它时期(P<0 05)。肌肉组织中IGF 1含量高于肝脏组织,肌肉组织IGF 1含量在3、21、35日龄时都显著高于出生日(P<0 05)。(2)肝脏细胞膜GHR结合活性在出生日显著高于3、21日龄(P<0 05),肝脏细胞膜GHR结合活性高于肌肉组织。(3)肝脏组织IGF 1、GHRmRNA的表达量均显著高于肌肉组织(P<0 05)。肝脏IGF 1mRNA的表达在出生日、21日龄时显著高于3、35日龄(P<0 05),GHRmRNA的表达在出生日显著高于其它日龄(P<0 05)。肌肉IGF 1、GHRmRNA的表达在出生日均显著高于其它日龄(P<0 05)。