PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒M基因截短表达及鉴定

目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。     

谷氨酰胺对断奶仔猪生长性能、营养物质表观消化率、空肠碱性磷酸酶活性及与肠道健康相关因子基因表达的影响

本研究的目的是探讨饲粮中添加谷氨酰胺对断奶仔猪生长性能、营养物质表观消化率、空肠碱性磷酸酶活性及与肠道健康相关因子基因表达的影响.将128头21日龄断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪按照体重、性别一致的原则随机分成2组,分别为对照组和添加1.00％谷氨酰胺组,每组4个重复,每个重复16头仔猪.在仔猪断奶后第10天和第30天,分别从每个重复中采集新鲜粪便样本,然后选择1头接近平均体重的仔猪进行屠宰,取空肠,刮取黏膜.试验期为30 d.结果表明:在断奶后第10天,与对照组相比,谷氨酰胺组平均日增重、干物质、粗蛋白质表观消化率和表观代谢能分别显著提高了19.05％、9.06％、4.77％和7.02％(P＜0.05),大多数必需氨基酸和非必需氨基酸表观消化率均有显著的提高(P＜0.05);在断奶后第30天,谷氨酰胺组干物质、粗蛋白质表观消化率和表观代谢能分别显著提高了5.90％、2.80％和6.43％ (P ＜0.05).在断奶后第10天和第30天,谷氨酰胺组仔猪空肠刷状缘碱性磷酸酶活性比对照组分别提高了30.09％(P＜0.05)和5.98％ (P ＞0.05).谷氨酰胺组空肠过氧化物酶体增殖体激活受体-γ和丙酮酸激酶基因mRNA表达水平在断奶后第10天比对照组分别下降了10.00％和30.00％ (P ＞0.05);在断奶后第30天比对照组分别显著下降了42.22％和44.52％ (P ＜0.05).在断奶后第10天和第30天,谷氨酰胺组空肠雷帕霉素靶蛋白基因mRNA表达水平分别比对照组提高了22.00％ (P ＞0.05)和22.38％ (P ＜0.05).以上结果提示,谷氨酰胺通过提高空肠碱性磷酸酶活性和调控与肠道健康相关因子基因表达水平来提高断奶仔猪的生长性能和营养物质表观消化率.     

抗菌肽对蛋用仔公鸡生长性能、免疫指标及空肠组织相关细胞因子基因mRNA表达的影响

本试验旨在研究饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽对海兰褐蛋用仔公鸡生长性能、免疫器官指数及空肠组织相关前炎性细胞因子基因mRNA相对表达水平的影响.选用336只1日龄健康海兰褐蛋用仔公鸡,随机分为7组,每组4个重复,每个重复12只鸡.7组试鸡分别饲喂基础饲粮(对照组),基础饲粮+150mg/kg金霉素(抗生素组),基础饲粮+150、200、250、300、350mg/kg抗菌肽(抗菌肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V组),试验期为42d.结果表明:1)抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、V组平均日采食量显著低于对照组(P＜0.05),平均日增重各组之间差异不显著(P＞0.05),抗菌肽Ⅳ、V组料重比较对照组显著降低(P＜0.05).2)抗菌肽V组胸腺指数显著高于其他各组(P＜0.05),法氏囊指数较对照组、抗菌肽Ⅰ组显著提高(P＜0.05),抗菌肽Ⅳ、V组之间脾脏指数差异不显著(P＞0.05),与其他各试验组相比,抗菌肽V组脾脏指数显著升高(P＜0.05).3)抗菌肽V组白细胞介素-6基因mRNA相对表达水平较其他各组显著降低(P＜0.05),抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、V组干扰素-Υ基因mRNA相对表达水平较对照组显著降低(P＜0.05),抗菌肽Ⅳ、V组肿瘤坏死因子-α基因mRNA相对表达水平较对照组显著降低(P＜0.05).综上所述,饲粮抗菌肽可不同程度提高蛋用仔公鸡生长性能、免疫器官指数,并能有效降低前炎性细胞因子基因的mRNA相对表达水平,以添加350mg/kg抗菌肽效果为最好.     

丁酸梭菌对蛋用仔公鸡生长性能、免疫指标及空肠组织相关细胞因子基因mRNA表达的影响

本试验旨在探讨饲粮中添加丁酸梭菌对蛋用仔公鸡生长性能、免疫指标及空肠组织相关细胞因子基因mRNA表达的影响.选择240只1日龄健康海兰褐蛋用仔公鸡,随机分为6组,每组4个重复,每个重复10只鸡,各组分别在基础饲粮中添加0(对照组)、150mg/kg金霉素(抗生素组)和250、500、750、1000mg/kg丁酸梭菌,试验期为42d,分别在14、28、42日龄测定各组的生长性能,42日龄测定免疫器官指数、血清免疫指标及空肠组织相关细胞因子基因mRNA相对表达水平.结果表明:1)与对照组相比,1000mg/kg添加组在试验期内显著提高了蛋用仔公鸡平均体重和平均日增重(P＜0.05),添加各水平丁酸梭菌对全期平均日采食量和料重比的影响均不显著(P＞0.05).2)1000mg/kg添加组的脾脏指数显著高于对照组(P＜0.05),各组之间胸腺指数和法氏囊指数均差异不显著(P＞0.05).3)各丁酸梭菌添加组血清免疫球蛋白G(IgG)的含量与对照组相比均显著提高(P＜0.05),其中750mg/kg添加组、1000mg/kg添加组血清IgG的含量与抗生素组相比也显著提高(P＜0.05);1000mg/kg添加组血清免疫球蛋白A的含量最高,显著高于对照组和抗生素组(P＜0.05);各丁酸梭菌添加组血清补体3的含量与对照组相比均显著提高(P＜0.05).4)750mg/kg添加组、1000mg/kg添加组的空肠组织白细胞介素-6基因mRNA相对表达水平与对照组相比显著降低(P＜0.05),1000mg/kg添加组肿瘤坏死因子-α基因mRNA相对表达水平最低,与对照组相比差异显著(P＜0.05).结果提示,饲粮中添加适量的丁酸梭菌可在一定程度上提高蛋用仔公鸡的生长性能,促进免疫器官发育并提高免疫力,抑制炎症的发生.本试验条件下,1000mg/kg的添加量效果最好.     

The Effects of Selenium Source on Measures of Selenium Status of Mares and Selenium Status and Immune Function of Their Foals

The effect of organic and inorganic sources of selenium (Se) on measures of Se status of mares and their foals, Se concentrations of colostrum and milk, and indices of immune function of foals was studied. Twenty late-gestation Standardbred mares were randomly assigned to one of two groups. All mares received an identical balanced ration, except for the source of supplementary Se: one group received organic Se (Se yeast) and the other group received inorganic Se (sodium selenite), fed to deliver 0.3 mg/kg supplementary Se based on total ration dry matter. Mares received the experimental diet from 2 months before estimated due date until 1 month after foaling. Source of Se did not affect Se concentrations in maternal plasma, red blood cells, colostrum, or milk. At 1 month of age, foals from mares fed organic Se had higher red blood cell Se concentration than foals from mares fed inorganic Se (P < .05). Measures of immunity included serum immunoglobulin G concentration, lymphocyte proliferation in response to concanavalin A, and relative cytokine gene expression of stimulated lymphocytes (interferon gamma [IFNγ], interleukin [IL]-2, IL-5, IL-10, tumor necrosis factor alpha [TNFα]) and neutrophils (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα). Relative gene expression of IL-2, TNFα, and IFNγ by foal lymphocytes was associated with the source of Se supplementation provided to the mares. We conclude that the source of dietary Se provided to mares may influence the immune function of foals at 1 month of age through changes in relative gene expression of certain lymphocyte cytokines.     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。     

毛竹微管蛋白基因PeTua3的原核表达及其 功能初步研究

作为细胞骨架的重要组成部分,微管蛋白在细胞壁发育过程中起着重要的调控作用。采用RT-PCR技术从毛竹叶片中克隆到一个微管蛋白(Tua3)同源基因的cDNA序列,长1 356 bp,编码451个氨基酸,命名为PeTua3。构建原核表达载体pET-32b-PeTua3,并将其转入大肠杆菌中诱导表达。蛋白电泳检测结果表明:温度和诱导时间对PeTua3基因蛋白的表达影响差异显著,其中,在37℃用0.4 mmol.L-1IPTG诱导2 h的表达效果最好。用PeTua3基因体外表达的重组蛋白处理拟南芥种子,其幼苗上胚轴明显增粗,侧根增多;超薄切片显微观察显示,重组蛋白处理的拟南芥上胚轴和主根的薄壁细胞数量均增多,细胞体积变大,维管束增粗。     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

加减三黄汤对耐药大肠杆菌acrA mRNA表达水平的影响

为了解加减三黄汤对大肠杆菌耐药性的影响,采用实时荧光定量方法检测了外输泵acrA mRNA表达水平的变化。将100只昆明系小鼠分为阳性组(感染耐药性大肠杆菌2 751株和2 952株),阴性组,攻毒治疗组(2 751株+加减三黄汤,2 952株+加减三黄汤),8d后将鼠随机剖杀,取肝组织抹片培养大肠杆菌,做药敏试验,同时提取质粒,检测大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达量。结果显示,经加减三黄汤在体治疗后的大肠杆菌耐药性下降了,每μL中mRNA拷贝数为2 751株最高达1016,2 952株1015;用药后各菌株均有下降;相差极显著(P≤0.01),耐药性越大的拷贝数越多。表明加减三黄汤对耐药大肠杆菌外输泵基因acrA的mRNA表达水平影响与耐药性有一定的相关性。