大熊猫卵母细胞体外成熟及受精后的超微结构观察

用抽吸法和切割法采集死亡大熊猫卵泡卵母细胞进行体外培养和体外受精 ,对其培养前、培养后及受精后的卵母细胞进行了电镜观察。结果表明 ,( 1 )大熊猫卵母细胞中富含卵黄颗粒和卵黄泡 ;( 2 )经过 2 2 h的培养 ,大熊猫卵母细胞在超微结构上表现为成熟卵的特征 ;( 3)大熊猫卵母细胞中的线粒体为基质密度浅且均匀的线粒体。     

家兔卵母细胞体外受精研究

以家兔为试验动物,人工采集公兔精液,经体外获能后,与从母兔输卵管获取的成熟卵母细胞进行体外受精和培养。结果表明:①卵龄14～15h卵母细胞体外受精后卵裂率和8～16细胞百分率均显著(P<0.05)高于卵龄16～17h卵母细胞;②L-谷氨酰胺对卵母细胞体外受精及受精卵体外发育具有促进作用,但随着添加量的增加其作用减弱;③培养液DMEM+10%FBS组卵裂率、桑椹胚及囊胚百分率均显著(P<0.05)高于TCM-199+10%FBS组及RM-199组。     

影响山羊体外胚胎生产的主要因素

研究了不同成熟培养时间（21、242、7 h）、FSH剂量（0、0.02、0.04、0.06 AU/mL）和激素组合（FSH＋LH＋E2、FSH＋LH、LH＋E2、FSH＋E2）、氨基酸以及负压低氧条件（-300 mmHg2、%CO28、%～10%O2）对山羊卵母细胞体外成熟/体外受精（IVM/IVF）的影响。结果表明：山羊卵母细胞成熟培养以24～27 h较为适宜;添加FSH组的受精卵裂率显著高于未添加组（P〈0.01）,添加剂量以0.02～0.04 AU/mL效果为最佳;LH对山羊的IVM/IVF无显著影响;E2添加对山羊IVM/IVF有负面影响,使囊胚发育率显著降低（P〈0.05）。在成熟液中添加必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）均能显著提高受精卵裂率（P〈0.05）。负压低氧环境对山羊卵母细胞的体外成熟无显著影响,但是不利于山羊的体外受精,使受精卵裂率极显著降低（P〈0.01）;负压低氧环境对提高胚胎发育率的作用不明显。     

脱羰秋水仙碱(DM)辅助去牛卵母细胞核的研究

受体细胞去核是核移植关键步骤之一。利用脱羰秋水酰碱（Demecolcine,DM）显示牛卵母细胞染色体的位置进行去核,主要从以下几个方面进行了试验：卵母细胞在DM中孵育浓度、卵母细胞在DM中孵育时间及卵母细胞成熟时间对显示效果的影响。结果表明：（1）成熟牛卵母细胞用离子霉素激活5 min,DM孵育2 h完全诱导去核,结果没有见到完全去核的卵母细胞;（2）挑选有第一极体的成熟牛卵母细胞,在浓度为0.5μg/mL的DM中孵育2 h显示率可达76.54%;（3）牛卵母细胞在成熟18 h可以获得73.86%的显示效果。（4）在没有去卵丘细胞的卵母细胞中添加DM取得了更好的显示效果（80.82%）,囊胚的发育率也较其它组高,可达18.60%,说明未去卵丘细胞的卵母细胞添加DM更有利于显示染色体的位置,而且更有利于囊胚的发育。利用DM显示染色体的位置不仅可以高效快速的去核,同时也避免了传统去核时荧光对卵母细胞的照射。     

The Construction of the Goat Ovary Melatonin Signal Specific Vectors pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT and pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A and MTNR1B

This study intended to construct an oocyte-specific expression vector (GDF9-ASMT) for melatonin (MLT) synthetase acetylserotonin methytransferase (ASMT),and granule (luteal) cell-specific expression vector (Cyp17-MTNR1A,MTNR1B) for MLT receptors MTNR1A and MTNR1B,the construction of the above vectors provided carrier materials for further production of transgenic sheep with high fertility.First,the goat GDF9 and Cyp17a1 promoter sequences were amplified separately.Then,the full-length CDS sequences of ASMT,MTNR1A and MTNR1B genes were amplified,and ASMT gene was connected to the downstream of GDF9 promoter by enzyme-cutting,with MTNR1A and MTNR1B respectively connected to the downstream of Cyp17a1 promoter to prepare Pro/GDF9-ASMT,Pro/Cyp17-MTNR1A and Pro/Cyp17-MTNR1B expression elements.Finally,the above-mentioned expression elements were integrated into the pcDNA3.1(+) vector by enzyme digestion,thereby constructing pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT,pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A and pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B eukaryotic expression vectors.After sequencing verification,the GDF9 and Cyp17a1 promoters amplified in this study were 2 496 and 2 497 bp in length respectively,and they were 98% homologous to the 2 500 bp region upstream of the start codons of the goat GDF9 and Cyp17a1 genes in GenBank database.The amplified ASMT,MTNR1A and MTNR1B CDS sequence lengths were 1 037,1 100 and 1 130 bp,and the homology with the standard sequences submitted by GenBank were 98%,98% and 99%.The amino acid sequence homologies was 97%,98%,99% respectively.The construction of the above vectors provided references for further production of melatonin transgenic sheep with high fertility.     

不同化学激活剂对小鼠卵母细胞的激活效果

为探讨不同激活剂的卵母细胞孤雌激活效果及激活胚体外发育情况,用乙醇、CaA23187、SrCl2、6-DMAP及CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理.结果显示,70 mL/L乙醇刺激小鼠卵母细胞时,以激活5～7 min的激活效果及孤雌胚发育较好,桑囊胚发育率可达29.11%;用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6～10 mmol/L为最佳处理浓度,3～6 h为最佳激活时间,桑囊胚发育率可达16.67%;以70 mL/L乙醇激活5 min,再用2 mmol/L 6-DMAP＋5 μg/mL CB激活3 h效果最佳,桑囊胚发育率高达35.77%.研究证实,小鼠卵母细胞经乙醇、6-DMAP和CB等复合激活后能较好地发育.     

超排程序对波尔山羊超排效果的影响

本试验以波尔山羊为研究对象,对超排时间、超排程序等方面的因素对供体超排效果的影响情况进行了研究。结果表明,在供体发情周期12~17天中任一天开始超排均能取得较好的超排效果,可用胚平均数为11.50~18.91。超排程序对超排效果的影响极显著(P<0.01),超排供体注射1针PGF2α同期发情时的超排效果最好,可用胚平均数为18.0。用240IU FSH对经产波尔山羊进行超排,注射1针PGF2α同期发情时能取得最佳的超排效果。     

供体发情状况对波尔山羊超排效果的影响

本试验以波尔山羊为对象,研究和讨论了PG-发情的时间、供体发情状况和配种次数等因素与供体超排效果之间的关系,同时对供体左、右卵巢的反应性和胚胎回收率进行了统计、比较。结果表明,缩短配种间隔,增加配种次数不能增加供体的可用胚数。供体发情对供体的超排效果有重要的体现,注射PG后37~48 h发情的供体的超排效果最好,发情异常的供体的超排效果比重复超排的供体的超排效果差(P>0.05)。超排供体左、右卵巢的超排反应性及回收率趋向一致,没有显著差异(P>0.05)。     

水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征

选择5月龄胎儿水牛的卵巢，采用石蜡切片、HE染色的光镜观察和DNA末端原位标记技术（TUNEL）进行了研究。结果表明：5月龄胎儿卵巢上分布着大量的凋亡细胞；在皮质部存在的大量腔前卵泡中，均匀分布有单个凋亡的卵泡细胞和卵母细胞，凋亡细胞的主要组织学变化是细胞缩小，核浓缩；DNA末端标记变化主要显示出TUNEL阳性。上述结果提示：水牛卵泡细胞和卵母细胞凋亡在胎儿时期已经存在，细胞凋亡是启动水牛腔前卵泡闭锁的潜在机理。     

牦牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究了不同采集方法和不同培养液对牦牛卵母细胞体外成熟的培养效果。结果:在牦牛乏情期,每个卵巢平均回收卵数为(9.33±4.30),可用卵数为(5.63±4.19)。将牦牛卵丘卵母细胞复合体分别置于5种成熟培养液中培养,成熟率分别为75.56%、71.11%、81.33%、77.33%和77.78%,卵裂率分别为42.22%、33.33%、49.33%、46.67%和42.22%,其中C的成熟液效果最好。来自卵巢表面卵泡的COCs的成熟率(81.33(vs69.33(,P>0.05)高于来自卵巢内卵泡的COCs,卵裂率(49.33%vs34.67%,P<0.05)显著高于来自卵巢内卵泡的COCs。来自明亮卵泡的COCs的成熟率(81.33%vs33.33%,P<0.01)和卵裂率(49.33%vs3.33%,P<0.01)极显著高于来自混浊卵泡的COCs。