辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

鸡Perilipin1基因的克隆及亚细胞定位

本研究旨在克隆鸡(Gallus gallus)脂滴包被蛋白基因(Perilipin1)的cDNA序列,并检测其在鸡前脂肪细胞分化过程中的亚细胞定位.本研究以7周龄肉鸡腹部脂肪组织为材料,采用RT-PCR和RACE的方法扩增并克隆了鸡Perilipin1基因的5'UTR、CDS和3'UTR片段,分析了该基因的结构;以鸡原代前脂肪细胞为材料,利用免疫荧光及激光共聚焦技术,在诱导分化的不同时间点(12～120 h),检测了鸡Perilipin1在前脂肪细胞中的表达位置.结果表明,本研究获得的鸡Perilipin11基因5'UTR、CDS和YUTR序列总长度为2 379 bp,该基因由9个外最子、8个内含子组成(ATG位于第二外显子上);在鸡原代前脂肪细胞诱导分化过程中,Perilipin1始终包被在脂滴周围.综上,本研究成功克隆了鸡Perilipinl基因的完整cDNA序列并确定了Perilipin1在鸡前脂肪细胞分化过程中与脂滴的空间位置关系,该结果为深入开展鸡Perilipinl基因的功能研究,揭示鸡脂肪代谢的分子遗传机理提供了重要的理论依据.     

低温胁迫下马铃薯的数字基因表达谱分析

以马铃薯品种合作88为材料,利用数字基因表达谱(DGE)技术,对–2℃低温胁迫处理后的马铃薯叶片c DNA文库进行差异基因表达谱分析。结果表明,有28 505个基因受低温胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因13 703个,下调表达基因14 802个。GO功能显著性富集分析表明,DEGs主要涉及信号生物代谢过程、氧化还原过程、能量代谢、次生代谢过程以及催化活性。KEGG富集分析表明,上调表达基因主要富集于苯丙烷、光合作用天线蛋白、类胡萝卜素的生物合成、苯丙氨酸代谢及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物激素信号转导途径。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证4个DEGs在低温胁迫条件下的差异表达,其结果与DGE分析结果基本一致,证实了DGE测序结果的可靠性。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

大豆GmNRT1.2a和GmNRT1.2b基因的克隆及功能探究

拟南芥中硝酸盐的吸收、转运和分配是通过硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter, NRT)实现的。尽管之前的生物信息学分析推测大豆GmNRT1.2s可能参与共生固氮过程,但尚未开展相应的功能研究。本研究通过对其表达模式分析収现,GmNRT1.2a和GmNRT1.2b分别在根和叶中高表达,且受硝酸盐诱导,在接种根瘤菌与结瘤因子(nodfactors,NFs)后表达量明显升高。功能研究结果显示,过表达GmNRT1.2a或GmNRT1.2b后大豆根瘤数目显著增加。本研究为深入探究GmNRT1.2a和GmNRT1.2b调控大豆共生固氮过程的分子机制提供了一定的数据支持。     

棉花蔗糖合成酶基因家族在纤维发育期时空表达模式分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase)是调控植物糖类代谢的关键酶之一,在植物生长发育及渗透调节过程中起着重要的作用。该酶为多基因家族,各成员在植物不同组织及不同发育阶段发挥不同的作用。陆地棉(Gossypium hirsutum)中有15个Sus成员,本研究利用转录组高通量测序及实时定量PCR技术,检测了该基因家族的表达模式。结果表明,Gh Sus1D、Gh Sus3A、Gh Sus3D和Gh Sus6D在起始期(0~3 DPA)大量表达;GhSus7D在10 DPA的纤维中表达量快速增加,达到同期突变体胚珠的4.7倍;Gh Sus1A、Gh Sus5D在纤维伸长期(5~15 DPA)表达量显著高于胚珠,分别在10 DPA、15 DPA时达到峰值;Gh Sus3A、Gh Sus3D、和Gh Sus6D在纤维发育(15 DPA)时表达量重新上升,且在20 DPA时仍处于较高表达水平。Sus基因家族组织表达模式分析表明,它们在陆地棉品种徐州142野生型和突变体中的组织表达模式基本相同,根、茎、叶、花中没有显著差异。但不同Sus基因具有不同的组织表达特异性。     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。     

文心兰HSP70基因的克隆及表达分析

为研究文心兰热激蛋白70基因（命名为OnHSP70）的分子特性及表达特点,以文心兰‘柠檬绿’（Oncidium hybridum ‘Honey Angel’）为材料,采用RT-PCR技术克隆OnHSP70,利用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析其在不同组织及不同非生物胁迫处理下的表达特点。生物信息学分析表明：该基因开放阅读框为1944 bp,编码647个氨基酸,翻译的蛋白为稳定蛋白,属于HSP70超家族,其蛋白二级结构由41.11%的α-螺旋、17.77%的延伸链、7.73%的β-转角和33.38%的无规卷曲组成,具有2个高度保守的功能域。聚类分析表明：该蛋白与铁皮石斛和深圳拟兰的HSP70亲缘关系较近。qRT-PCR分析表明：文心兰HSP70在4种不同组织器官中具有表达差异性,在花中的表达量最高;高温处理后基因的表达量明显上升;40 ℃高温胁迫4 h时表达量达峰值;茉莉酸甲酯及水杨酸处理时表达量呈现下调响应。本研究为后期该基因功能研究及提高文心兰对高温的适应性提供理论基础。     

Study on Developmental Expression of ApoCⅡ Gene mRNA in Liver Tissues of Pigs

The aim of this study was to investigate the developmental patterns of ApoCⅡ gene mRNA in liver in Mashen and Large White pigs, and study the relationship between the expression level of ApoCⅡ and the lipid metabolism in pigs.The mRNA relative expressions of ApoCⅡ gene in liver at seven stages of 1,30,60,90,120,150,and 180-day old in Mashen and Large White pigs were determined by quantitative Real-time PCR.The results showed that the developmental trend of ApoCⅡ mRNA expression in liver between Mashen and Large White pigs was different.The ApoCⅡ mRNA abundance was decreased from birth to 60-day old,then increased at 90-day old,and decreased again after that in Mashen pig.However,the relative expression amount in Large White pig was gradually decreased from birth to 150-day old and increased again at 180-day old.Except for the ApoCⅡ mRNA expression amount at 1-day old,the differences of the expression amount at other stages in Mashen and Large White pigs were significant or extremely significant (P<0.05 or P<0.01).The ApoCⅡ mRNA expression in liver was affected by age and breed,and could play an important role in lipid metabolism in pigs.