边缘革蜱Dm 86基因表达及免疫原性分析

【目的】 研究Bm86同系物Dm86基因及其编码蛋白,为抗边缘革蜱疫苗候选抗原提供基础。【方法】 以边缘革蜱饱血雌蜱cDNA为模板扩增克隆Dm86基因,分析生物学特性及生活史各阶段表达水平,截短基因构建重组质粒,经IPTG诱导后SDS-PAGE鉴定,纯化蛋白,制备多克隆抗体进行Western Blotting 鉴定。【结果】 PCR扩增获得了1 773 bp目的片段,Dm86蛋白由591个氨基酸组成,分子量为64 857.81,理论等电点为6.78,酸性,具有不稳定性、亲水性和多个B细胞抗原表位;Dm86基因在边缘革蜱不同阶段均有不同程度的表达,饱血蜱阶段的表达量较高;重组蛋白大小为39kDa,以包涵体形式表达;抗体效价可达1∶25 600,能够识别重组蛋白。【结论】 Dm86重组蛋白具有一定的反应原性和免疫原性。     

兔病毒性出血症研究进展及其在国际上的评价

兔病毒性出血症是中国首先报道的一种毁灭性传染病。此病在各种病名下遍及欧洲大部分地区，但均无病原特征的描述。兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）是一种新发现的病毒，直径３２～３４ｎｍ，二十面体对称，无囊膜，存在于感染细胞的核和胞浆内。它对酸（ｐＨ３）、热（６０℃）、乙醚（２０％）和ＭｇＣｌ２（１ｍｏｌ／Ｌ）有坚强的抵抗力。在ＣｓＣｌ中的浮密度为１．３６～１．３８ｇ／ｃｍ２；在蔗糖梯度中的沉降系数为１６２Ｓ。它能凝集人红细胞，滴度可达１０×２１８以上。在细胞培养中很难适应。核酸为线状单股ＤＮＡ，末端有发夹结构。用体外合成的双股ＤＮＡ，取其酶切片段插入ＢＳ质粒后，转化ＤＨ大肠杆菌。从重组质粒提取的２个片段（ｐＹＣ－２和ｐＹＣ－９）以同位素或光敏生物素标记后，能与ＲＨＤＶ和一部分细小病毒杂交。在诊断中最有效的血清学试验为ＨＡ－ＨＩ和ＥＬＩＳＡ。灭活疫苗效果确实，已为所有发病各国所证实。根据以上特征，ＲＨＤＶ被认为是一种细小病毒样病毒，但欧洲学者持不同看法。     

抗草甘膦转基因玉米AG16分子特征和抗性鉴定

抗草甘膦转基因玉米(Zea mays)能有效降低杂草防治成本,具有重要的应用前景。浙江大学转基因抗虫植物和生物安全实验室前期通过农杆菌介导法,以玉米Hi-Ⅱ品种为受体导入新型抗草甘膦基因G10evo,获得不同的抗草甘膦玉米转化系。在此基础上,筛选了具有良好草甘膦抗性的转基因玉米转化系AG16。本研究利用PCR、Western杂交、Southern杂交、ELISA等方法对AG16进行分子特征检测,并对AG16的草甘膦抗性水平进行鉴定。结果表明,G10evo在AG16中为单拷贝插入;G10evo蛋白在AG16的根、茎和叶组织中表达;ELISA分析表明,草甘膦喷洒前,嫩茎中G10evo蛋白的表达量达到9.975μg·g-1。温室中草甘膦抗性测定结果显示,AG16能抗4~8倍田间浓度的草甘膦,远高于草甘膦在实际生产中的使用量。因此,AG16草甘膦抗性水平达到生产需求,具有产业应用潜力,为培育具有自主知识产权的抗草甘膦玉米提供了种质资源。     

转基因及相关亚品系鱼腥藻的纯化

转基因蓝藻纯化是研究其生理、生化、分子生物学、营养学、药理学、毒理学等必不可少的环节,更是其作为生产原料的基础。传统纯化方法仅对不同物种间的分离进行了讨论,尚未涉及野生藻种和转基因突变株在实验和生产中相互污染情况下的鉴别和分离。本文的转基因藻纯化方法先后从种群、细胞、分子3个层面纯化分离了藻种。该方法使用平板划线的方法将杂藻杂菌与鱼腥藻分离,再使用核酸电泳、RT-qPCR、Western Blot将鱼腥藻野生种、转空载体突变株以及转目的基因突变株3个亚品系逐步分离。纯化分离后的藻株生长速率得到了提高,目的基因的表达效率增长,生产目的蛋白的产率自然增长。本研究对转基因藻在实验和生产中出现的一些问题提出了相应的解决方案,对转基因微藻的应用具有积极的作用。     

Detection of Potyviral Nuclear Inclusion b Proteins by Monoclonal Antibodies Raised to Synthetic Peptides

Potyviral nuclear inclusion b protein (NIb), the RNA-dependent RNA polymerase, contains three highly conserved regions. Peptides corresponding to these regions were synthesised and used for immunisation. A panel of monoclonal antibodies was obtained. Most of the MAbs reacted with the peptides and a recombinant NIb of PVY in PTA-ELISA. Two of them specifically detected native NIb of potato A, potato V, potato Y, plum pox and turnip mosaic potyviruses in extracts of infected plants in Western blots. Time course experiments revealed that NIb protein can be first detected on the fifth day after infection.     

利用大白菜小孢子胚状体获得抗除草剂转基因植株

大白菜小孢子培养获得的子叶期胚状体,经粉碎的玻璃碴摩擦后,与农杆菌共培养,在加筛选剂Ｂａｓｔａ（和ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ ５ｍｇ／Ｌ）的培养基上,再生出数株绿苗。自交留种后,对其后代苗期进行的Ｂａｓｔａ抗性鉴定显示,有４株抗此除草剂。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,抗性植株的基因组中各有一个ｂａｒ基因插入位点。对转化株的小孢子进行再培养,后代小孢子植株对Ｂａｓｔａ抗性的分离比显示,此转基因     

疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径