牛乳腺EST分析和牛基因索引功能的注释

乳腺功能基因组学研究需要收集一些合适的cDNA序列来对各种亚细胞不同发育和运作阶段的基因表达形式进行评估。为了更好的捕捉基因表达的范围，我们用混合的牛乳腺细胞建立了1个标准化的cDNA文库，产生了23202个EST，存放的基因库中。这些在牛基因索引中带有序列的EST集形成当前23883个试验性分析序列中的5751个。5751个中的87％仅含有1－3个乳腺来源EST。相反，18％的乳腺EST有12个基因与TC序列相似，这些结果说明标准化文库仅有部分作用，因为EST中，能在泌乳过程中大量转录的基因的减少可能是由于合并引起的。为了更好的评价乳腺文库中的新内容，并把它们增加到现存的注释中（包括牛序列元件、基因一致性序列和人类基因组序列），我们对人和鼠基因诱变和在TOGA的基因非线性化进行测试，并把其结果增加到现有BtGI注释中。35000多个牛元件明显超过了人类基因组序列，而且一些与人类表达序列相关的排列（3％）的位置是独立的。由于3445TC序列与任何数据无明显相似性，代表这些元件中的23种乳腺源cDNA克隆被进一步进行分析用于表达和新异。其只驻有一个克隆符合标准，这相相应基因是一个分化的异端或表达对牛来说是特异的。结果说明，用作标志哺乳动物的转座轴和鉴定这些基因的牛序列表达数据仅针对反刍动物。     

欧文氏杆菌CXJZ95-198基因组文库的构建

采用改良鸟枪法构建了草本纤维精制高效菌种Erwinia carotovora CXJZ95-198的基因组文库，结合透明圈法，筛选到了8个甘露聚糖酶基因阳性克隆，并采用PCR方法对它们进行了分析鉴定，结果表明它们含有同一个甘露聚糖酶基因。     

制备棉花高分子量线粒体DNA的方法

细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)是普遍存在于植物中的生物学现象.细胞质雄性不育受核质两套遗传系统的控制,决定不育的胞质基因在线粒体基因组中.高等植物的线粒体在小孢子的发育过程中起着重要作用,并且与CMS密切相关.因此,通过构建线粒体基因组BAC文库,克隆相关的线粒体基因,有助于了解CMS不育的机理.     

关于高校图书馆文库文献收集的问题

概括了高校文库文献收集工作的内容以及当前文库文献收集存在的问题,提出争取领导的支持,变图书馆行为为学校行为;把握时机,拓展收集渠道;设立专项经费,开展有偿征购;提高人员素质,培养敬业精神是加强文库文献收集的主要措施.     

猕猴桃基因组DNA文库的构建

采用改良CTAB法提取美味猕猴桃(Actinidiadeliciosacv.Bruno)基因组DNA,经CsCl密度梯度离心纯化后用Sau3AI部分酶切,通过透析袋电泳的方法分级回收,剔除14kb以下的片段,回收长为14～23kb的酶切片段。部分酶切片段经dATP和dGTP部分补平后与LambdaFIXII载体连接,连接产物用GigapackⅢPackagingExtract进行包装,最后得到含有1.05×106pfu的基因组文库,扩增后文库滴度为2.5×109pfu/mL。利用6对根据植物基因保守区或猕猴桃基因序列设计的专一引物对基因组文库和基因组DNA进行PCR扩增,均得到与预计长度相符的目的基因片段。RR     

自贡大公古盐井中嗜盐菌的Na~+/H~+离子逆转运蛋白基因筛选

[目的]筛选四川自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白基因,并对其结构和编码蛋白进行分析。[方法]构建自贡大公古盐井中嗜盐微生物的Na+/H+离子逆转运蛋白宏基因组文库,通过与Na+/H+离子逆转运蛋白基因缺陷宿主菌株E.coliKNabc的功能互补筛选Na+/H+离子逆转运蛋白基因。并通过生物信息学方法对该基因的起始密码子、终止子、ORF、-35区、-10区和SD序列以及编码蛋白的分子量、等电点、疏水区域、跨膜区域、系统进化和耐盐特性进行分析。[结果]筛选到1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因m-nha,该基因能够赋予E.coli KNabc在盐和碱性条件下良好生长的能力。[结论]由于m-nha编码蛋白在氨基酸序列和结构上不同于以往报道的Na+/H+离子逆转运蛋白,故鉴定该基因为1个新的Na+/H+离子逆转运蛋白基因。该研究结果对于理解古盐井中嗜盐微生物的嗜盐机制,开发利用古盐井中的基因资源及寻找新的耐盐基因具有重要的意义。     

水稻cDNA酵母表达文库的构建及重金属镉胁迫相关基因的初步筛选

提取经重金属胁迫处理的水稻幼苗总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成cDNA,利用Gateway技术将cDNA构建到入门载体pDONR222后,再经LR反应重组到酵母表达载体pYES2-DEST52上,获得水稻cDNA表达文库。检测表明,所构建的cDNA文库能达到后续试验要求。使用重金属镉敏感酵母突变株ycf1Δ进行水稻中重金属镉耐受相关基因筛选,获得多个可以恢复表型的酵母单克隆。提取质粒并测序分析后可知涉及到水通道蛋白、蛋白酶抑制剂以及金属硫蛋白等不同基因,筛选所得基因即为水稻应答重金属镉胁迫的候选基因。     

小麦cDNA文库构建方法的改进及优化

基于SMART法,优化cDNA文库构建方法。将常规SMART法中的限制性内切酶SfiI替换成BsaI,在引物两侧分别加入BsaI-XhoI和BsaI-BamHI酶切位点,仅使用BsaI单酶切即可获得两不同的粘性末端,可用于连接任意载体。应用此方法构建了小麦cDNA文库,获得2.7×104个独立克隆,文库平均长度500bp。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

A/J小鼠感染猪链球菌2型后脾脏消减cDNA文库的构建及相关差异基因表达分析

为了分离与猪链球菌2型感染密切相关的基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术构建了8周龄A/J小鼠感染猪链球菌2型后的脾脏消减cDNA文库,并对其中169个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后共获得110条差异表达序列标签(EST)。利用GenBank的BLAST软件分析比较核酸和蛋白质同源性,发现共有36个基因与这些EST具有高度的同源性,它们分别参与细胞成分、免疫、信号转导、凋亡、转录等重要功能。这些差异表达基因主要有ATP/GTP结合蛋白1(Agtpbp1)、天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸盒多肽5、核蛋白p68、ATP-依赖RNA解旋酶、真核生物转录因子2亚基(Eif2s2)、Na+/K+-ATP酶转运β3多肽、溶菌酶1、溶菌酶2等基因。结论:这些差异表达基因在猪链球菌2型感染过程中可能发挥重要功能。