杆状病毒AcMNPV orf59基因的克隆表达、抗体制备及亚细胞定位

用PCR方法从苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）基因组中扩增到orf59基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建pET-Ac59质粒,再将该质粒转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为30kDa的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞（Sf9）中orf59基因的表达,结果显示：在感染后的细胞中有两条分子量分别约为38kDa和25kDa蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现：在病毒感染的晚期,Ac59蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。这些研究为下一步深入进行Ac59功能的研究奠定了一定的基础。     

Construction of the recombinant baculovirus AcMNPV with cathepsin B-like proteinase and its insecticidal activity against Helicoverpa armigera

The Helicoverpa armigera cathepsin B-like proteinase (HCB) has been shown to have a wide spectrum of substrates. It has been involved in the degradation of yolk protein during embryonic development and also in the decomposition of the adult fat body. To study the possibility of using HCB to improve the insecticidal activity of bioinsecticides, it was inserted into the pFASTBACDUAL-green fluorescent protein (GFP) donor plasmid under the strong polyhedrin promoter, and the polyhedrin gene was retained behind the HCB gene so that the virus could orally infect the host and survive in the natural environment. After the recombinant plasmid transfected the Sf21 cells, the recombinant baculovirus Autographa californica multiple nucleocapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)-GFP-HCB-Polh⁺ was produced. A 37-kDa recombinant procathepsin B was expressed in AcMNPV-GFP-HCB-Polh⁺-infected Sf21 cells and processed into 29/25-kDa mature forms. Gelatin zymography revealed that the proteolytic activities of the recombinant HCB and other proteases were activated or enhanced by HCB in AcMNPV-GFP-HCB-Polh⁺-infected larvae. Green fluorescence was observed earlier and was more intense in AcMNPV-GFP-HCB-Polh⁺-infected larvae than in HCB-free AcMNPV-GFP-Polh⁺-infected ones that were infected at the same time; this indicated that the AcMNPV-GFP-HCB-Polh⁺ virus spreaded faster in larvae than the AcMNPV-GFP-Polh⁺ virus. A bioassay revealed that infection with the AcMNPV-GFP-HCB-Polh⁺ virus shortened the median survival time of H. armigera larvae by 12 h as compared with those infected with the AcMNPV-GFP-Polh⁺ or the wild-type AcMNPV virus. These results suggest that HCB may possibly play a role in the recombinant virus in improving the rate of killing larvae.     

狂犬病病毒核蛋白在Bac-To-Bac/AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白,本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-NP;通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。SDS-PAGE、western blot和间接免疫荧光对表达的蛋白进行鉴定和反应原性分析。分别以重组杆状病毒表达的核蛋白、原核表达核蛋白为包被抗原进行ELISA检测。结果表明,在昆虫细胞中表达的狂犬病病毒重组核蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清特异性结合,其相对分子量约为50.5ku。以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的rNP-ELISA的敏感性、特异性、符合率分别为86.36%,89.83%,90.00%,优于大肠杆菌表达的RV核蛋白。说明杆状病毒系统表达的核蛋白是建立RV核蛋白ELISA抗体检测方法的理想抗原。     

AcMNPV LEF-10第21位突变对其活性的影响

【目的】对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）晚期表达因子LEF-10的第21位保守氨基酸残基进行饱和点突变，研究该位点突变对AcMNPV活性的影响，为进一步研究LEF-10朊病毒特性及其在病毒复制中的作用奠定基础。【方法】同源序列比对发现，LEF-10第21位亮氨酸残基高度保守。对pTriEx质粒载体上LEF-10第21位的亮氨酸残基通过异位回补进行饱和突变，将构建好的重组质粒与线性化的BacmidΔlef-10共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建重组病毒，研究LEF-10第21位上不同氨基酸残基对病毒活性的影响。同时联用Red/ET基因敲除系统和rpsl反向筛选系统对AcMNPV Bacmid的LEF-10基因进行原位突变，突变后的线性化Bacmid与pTriEx-p(p10)-dsRed质粒共转染草地贪夜蛾Sf9细胞构建原位突变型病毒，研究点突变对重组病毒活性的影响，并通过流式细胞术检测突变型病毒对晚期基因表达的影响。【结果】异位回补点突变重组病毒和原位点突变重组病毒转染和感染Sf9细胞的结果均表明，当LEF-10第21位亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、脯氨酸残基、半胱氨酸残基和甲硫氨酸残基时，可以拯救LEF-10缺陷型病毒，并产生具有感染性的重组病毒，但其他突变型重组病毒均为致死突变。将7种原位突变重组病毒分别以高MOI（MOI=10）和低MOI（MOI=1）感染Sf9细胞，结果表明低MOI感染Sf9细胞时，7种重组病毒外源蛋白的表达水平相当；高MOI感染Sf9细胞时，7种重组病毒外源蛋白的表达水平差异明显，其中突变为丙氨酸残基的重组病毒将外源蛋白的表达维持在较高水平。【结论】LEF-10第21位氨基酸残基对其功能起着至关重要的作用，该位点氨基酸残基的性质影响AcMNPV的活性。