苹果矮化砧木GA20氧化酶基因的克隆及其表达分析

为了研究GA20氧化酶基因在苹果矮化砧木中的分子特征和表达特征,利用RT-PCR方法从苹果矮化砧木2号和36号c DNA中克隆了GA20氧化酶基因(GA20ox1),并对该基因及其编码氨基酸序列以及在不同时期砧木及嫁接品种中的表达分别进行了分析。结果表明,GA20ox1基因c DNA编码序列长1 179 bp,推导编码393个氨基酸(包括终止密码子),预测蛋白相对分子质量44.3 k Da,理论等电点5.89,编码的蛋白质包含GA20ox1基因家族所具有的特征保守结构域,系统进化分析表明该蛋白序列与苹果SH40的同源性达到96.9%。实时荧光定量PCR分析显示:36号砧木在6月份GA20ox1基因表达强度显著低于八棱海棠对照,而7-8月份的均显著高于对照,其上嫁接的品种7月份表达强度显著低于对照。在7-8月份2号砧木及嫁接品种GA20ox1基因的表达强度均显著低于对照。     

分枝杆菌噬菌体CJAUS 5株lysA基因的克隆与表达

为了研究分枝杆菌噬菌体裂解酶lys A的生物学特性及对宿主菌的作用,对分枝杆菌肌尾噬菌体CJAUS5的lys A基因进行PCR扩增、克隆和原核表达,并利用生物信息软件对其序列进行分析。结果显示,CJAUS5-lys A基因与Gen Bank中分枝杆菌肌尾噬菌体的lys A基因具有高度同源性;克隆基因在大肠杆菌BL21中获得了成功表达,重组蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为52 k Da;lys A蛋白保守区域分析结果显示,lys A包含具有酰胺酶活性的肽聚糖识别蛋白(PGRP)超家族,表明Lys A可能具有裂解肽聚糖的能力。本研究克隆表达出分枝杆菌噬菌体CJAUS5裂解酶Lys A,为进一步研究其相关功能奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒S1蛋白基因的克隆与原核表达

根据GenBank中IBV基因序列,设计合成一对引物,成功地从IBV H52基因组中扩增了S1基因。经测序证实该序列全长1 685 bp,编码538个氨基酸。为便于表达,对其进行弃信号肽克隆,然后定向连接到表达载体中获得重组表达质粒pGEX-S1,转入受体菌,经诱导成功的表达了重组蛋白GST-S1。SDS-PAGE显示,该蛋白约为80 kD,占菌体总蛋白的8%,West-blot表明,其具有良好的免疫学活性。IBV S1基因的克隆和表达,为研究病原与细胞相互作用、开发基因工程疫苗奠定了基础。     

斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析

利用RT-PCR和RACE技术获得了斜纹夜蛾精氨酸激酶基因的全长cDNA,命名为SlAK,其GenBank登录号为HQ840714。序列分析结果表明:该cDNA全长1373 bp,其中5′和3′UTR的长度分别为65和240 bp;其开放阅读框位于66～1133 bp,编码355个氨基酸。同源性分析结果显示,精氨酸激酶基因蛋白序列享有较高的同源性,该序列具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列CPTNLGT、酶活性位点氨基酸和能形成离子耦合结构的氨基酸。SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫的头部、中肠、脂肪体和体壁内均有表达,以在中肠内的表达水平最高;SlAK基因在斜纹夜蛾幼虫不同发育期的表达量不同,mRNA表达水平在3龄达到最高峰。     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。     

卡尼鄂拉蜂越冬工蜂咽下腺转录组学分析

为探究卡尼鄂拉蜂(Apis mellifera carnica)越冬工蜂在越冬、春繁和淘汰3个阶段咽下腺(HGs)的调控变化规律,对蜂群3个关键阶段工蜂咽下腺进行转录组测序,差异表达基因筛选、功能富集等一系列转录组学方法分析工蜂咽下腺活性功能基因的变化,并通过qPCR对测序结果进行验证。结果表明:在3个阶段工蜂咽下腺组织中共鉴定到21 441个基因,其中737个基因在不同阶段的组织中差异表达。对差异表达基因分析发现,蜜蜂咽下腺有30个基因与糖类和能量代谢、转录因子等功能相关,其中在蜜蜂春繁阶段高表达15个,越冬阶段7个,淘汰阶段3个。这一研究提示季节性介导的咽下腺活动变化与冬春季节期间数百个基因的表达水平和模式变化显著相关。     

文心兰HSP70基因的克隆及表达分析

为研究文心兰热激蛋白70基因（命名为OnHSP70）的分子特性及表达特点,以文心兰‘柠檬绿’（Oncidium hybridum ‘Honey Angel’）为材料,采用RT-PCR技术克隆OnHSP70,利用生物信息学方法分析其分子特性,通过qRT-PCR技术分析其在不同组织及不同非生物胁迫处理下的表达特点。生物信息学分析表明：该基因开放阅读框为1944 bp,编码647个氨基酸,翻译的蛋白为稳定蛋白,属于HSP70超家族,其蛋白二级结构由41.11%的α-螺旋、17.77%的延伸链、7.73%的β-转角和33.38%的无规卷曲组成,具有2个高度保守的功能域。聚类分析表明：该蛋白与铁皮石斛和深圳拟兰的HSP70亲缘关系较近。qRT-PCR分析表明：文心兰HSP70在4种不同组织器官中具有表达差异性,在花中的表达量最高;高温处理后基因的表达量明显上升;40 ℃高温胁迫4 h时表达量达峰值;茉莉酸甲酯及水杨酸处理时表达量呈现下调响应。本研究为后期该基因功能研究及提高文心兰对高温的适应性提供理论基础。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。