褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性形成

【目的】 表皮蛋白是昆虫表皮重要的结构物质,大量研究已经证实表皮蛋白基因参与介导昆虫抗药性形成。以赤拟谷盗（Tribolium castaneum）为研究对象,解析表皮蛋白基因TcCP14.6（cuticle protein CP14.6）和TcLCPA3A（larval cuticle protein A3A）在昆虫磷化氢抗性形成过程中的作用。【方法】 采用联合国粮农组织（FAO）推荐的磷化氢熏蒸方法对采自5个省份赤拟谷盗的磷化氢抗性水平进行测定。基于赤拟谷盗基因组数据获得TcCP14.6和TcLCPA3A的cDNA序列,利用在线生物信息学分析软件预测其编码的氨基酸序列、信号肽和保守结构域。分别提取赤拟谷盗不同组织（头、胸、腹的表皮、翅、足、肠道、马氏管和脂肪体）、不同磷化氢抗性水平以及磷化氢胁迫后试虫的总RNA。以TcRPS和TcRPL为内参基因,运用RT-qPCR技术分析TcCP14.6和TcLCPA3A在赤拟谷盗不同组织、不同磷化氢抗性水平和药剂胁迫下的表达模式。最后,通过RNA干扰技术结合生物测定方法分析TcCP14.6和TcLCPA3A与赤拟谷盗磷化氢抗性的关系。【结果】 生物测定结果表明,江苏（JS,RR=1.7）和云南（YN,RR=3.0）种群对磷化氢保持敏感,湖南种群（HN,RR=20.2）表现为中等抗性,四川（SC,RR=395.4）和广东（GD, RR=862.7）种群表现为极高抗。序列分析结果表明TcCP14.6和TcLCPA3A蛋白均包含信号肽和保守的几丁质结合域。RT-qPCR结果显示,TcCP14.6和TcLCPA3A均在赤拟谷盗表皮组织中高表达,而在内部器官（脂肪体、肠道、马氏管）中的表达量相对较低。此外,TcCP14.6表达量随磷化氢抗性水平的增加呈上调趋势,而TcLCPA3A表达量则呈下降趋势;赤拟谷盗经磷化氢熏蒸处理6 h,TcCP14.6和TcLCPA3A的表达量分别呈现上调和下调趋势。注射dsRNA分别干扰抗性（GD）和敏感（YN）种群两个基因的表达后再用LC₃₀的磷化氢浓度处理试虫。与对照相比,TcCP14.6基因沉默后赤拟谷盗的死亡率显著升高,而TcLCPA3A基因沉默后试虫死亡率显著下降。【结论】 表皮蛋白基因TcCP14.6和TcLCPA3A参与介导赤拟谷盗对磷化氢的抗性。     

葡萄卷叶伴随病毒2号p24蛋白基因转化烟草的研究

以含有葡萄卷叶伴随病毒2号(Grapevine leafroll-associated virus 2,GLRaV-2)p24蛋白基因的T载体(p-G2-p24)为模板,PCR扩增该蛋白基因的全长序列及其5''端长300 bp 的正反向片段。将p24蛋白基因全长序列定向克隆到表达载体pCsuper 1300+上,得到重组质粒pCsuper1300-p24。将正反向片段先后插入具内含子的中间载体pBSint上,得到重组的中间载体pBSint-p24-F-R。然后用HindⅢ和SacⅠ双酶切pBSint-p24-F-R,将切下的带内含子的正反向串联片段定向克隆到植物表达载体pCsuper 1300+上,得到含有发夹结构的RNAi重组质粒pCsuper-p24-F-R。将pSuper1300-p24和pCsuper-p24-F-R分别通过农杆菌浸润叶盘法转化本生烟。经过RT-PCR和PCR检测,分别获得了异源表达p24的T₀和T₁代阳性株系各34和12个,转化pCsuper-p24-F-R的T₀和T₁代阳性株系各17和7个。该结果可为p24功能研究及培育RNAi介导的抗病毒葡萄新种质提供试验材料。     

大麦条纹病菌基因Pgr03902致病功能研究

为明确基因Pgr03902(序列号：OP999070)是否参与调控大麦条纹病菌的致病性，为大麦条纹病菌致病机理的研究提供理论依据，本研究运用生物信息学、亚细胞定位和基因干扰技术初步研究了该基因功能。结果表明，Pgr03902基因开放阅读框大小为348 bp,编码116个氨基酸，编码蛋白二级结构中无规则卷曲较多，编码蛋白具有酸性、不稳定性、亲水性、无信号肽结构等特性；亚细胞定位结果显示，Pgr03902基因在细胞核和细胞膜上均有表达；采用PEG介导的原生质体转化法获得了1个干扰菌株ΔPgr03902,RT-qPCR结果表明，ΔPgr03902中Pgr03902基因表达量较野生型菌株QWC下降了60.79%(P<0.05),对干扰菌株的营养生长、菌丝形态观察以及致病性研究结果显示，ΔPgr03902生长速率和致病力均显著低于野生型菌株QWC(P<0.05)。以上结果表明，Pgr03902参与该菌的生长发育和致病过程。本研究初步明确了Pgr03902基因在大麦条纹病菌侵染过程中的功能，为进一步研究大麦条纹病菌与寄主之间互作奠定了基础。     

泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

【目的】探讨泛素结合酶E2T（UBE2T）在布鲁氏菌感染过程中的功能。【方法】构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，对其进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证，并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测UBE2T基因过表达效果。设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA（UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA），将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）试验，检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响。利用qRT-PCR，检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响，以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）基因相对表达量的影响。用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞，用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响，利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性及白细胞介素6（IL-6）、IL-18、IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子的水平。【结果】成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，过表达效果良好。3条siRNA中，UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳，其对UBE2T基因的沉默效率为84%。UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响。M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量；沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达，而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达，提高M5-90介导的Caspase-1表达。沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖，而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平，提高Caspase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平；而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平，抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平。【结论】泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用。     

单细胞分析研究二氧化氯对杀蚊细菌球形赖氨酸芽胞杆菌芽胞的影响

球形赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillus sphaericus（Ls）是应用广泛的蚊虫生物防治制剂，在实际应用时可能会遇到不利的环境因子或杀菌剂。本研究通过单细胞分析方法监测ClO₂处理后的单个Ls芽胞及其萌发过程，探究ClO₂对Ls芽胞结构和成分的影响及与芽胞萌发相关蛋白的影响，以及ClO₂的杀胞机制。经0.05%～0.3% ClO₂处理5 min后，36%～86%的芽胞不能形成单菌落。吡啶二羧酸钙（CaDPA）特征峰（1017 cm^-1）强度随处理程度增大有所降低，而蛋白质α-螺旋峰（1652 cm^-1）强度没有明显变化。ClO₂处理显著改变Ls芽胞的萌发动态，芽胞启动CaDPA快速释放的时间、完全释放的时间以及皮层水解完成的时间显著延长；而外源CaDPA仅能触发低浓度ClO₂（0.05%）处理的芽胞，且显著迟缓。表明ClO₂处理没有直接破坏芽胞内膜但严重损伤了与萌发相关蛋白的功能，特别是皮层水解酶容易失活。这可能就是被处理的芽胞可以启动芽胞萌发的最初步骤，而不能进一步发展为营养细胞的原因。