半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)黑色素聚集素受体(MCHR)表达特性及其与无眼侧黑化的关系

利用cDNA末端快速克隆技术(RACE)获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)2种黑色素聚集素受体(MCHR1和MCHR2)的cDNA全长序列,并采用定量PCR技术分析了MCHR mRNA的组织表达特性,研究了其与无眼侧黑化程度的关系.结果显示,半滑舌鳎MCHR1 cDNA序列全长为1685 bp,开放阅读框(ORF)长为1080 bp,编码359个氨基酸,与牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性高达83.3％.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR1与鲋形目、鲽形目和鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR2 cDNA序列全长为1626bp,ORF长为1044bp,编码347个氨基酸,与鲽形目同源性最高达到90％以上.系统进化分析显示,半滑舌鳎MCHR2与鲽形目、鲈形目鱼类聚为1个小分支.MCHR1 mRNA在鳃中表达量最高,而MCHR2 mRNA在有眼侧皮肤中表达量最高,性腺次之.另外,MCHR1和MCHR2 mRNA在其他组织中均检测到表达,这表明半滑舌鳎黑色素聚集素(MCH)可能通过内分泌方式和各组织中的MCHR介导参与生理调控.不同黑化面积表达分析显示,在无眼侧黑化发生早期,脑垂体中MCHR1 mRNA显著升高,在无眼侧50％黑化组达到峰值,皮肤中MCHR1 mRNA在无眼侧10％黑化组显著升高,其后保持较高水平;脑垂体和皮肤中MCHR2mRNA表达表现出一致的变化趋势,在无眼侧黑化发生早期都达到峰值,其后逐渐下降至相对较低水平.表明MCHR可能直接或通过其他信号通路参与了半滑舌鳎无眼侧黑化性状的调控过程.     

膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达.对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高.HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控.对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达.本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.     

性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)新型膜孕激素受体(mPRL)的定性定量表达分析

在牙鲆(Paralichthys olivaceus)繁殖周期,新型膜孕激素受体基因(mPR-Like,mPRL)在脑-垂体-性腺轴的表达变化规律与性腺发育成熟密切相关.为进一步研究牙鲆mPRL作用机制,本研究对其mRNA和蛋白的表达特征进行了分析.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现牙鲆mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织中的细胞学定位,发现mPRL mRNA主要分布在牙鲆性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑组织的神经元附近区域mPRL mRNA阳性信号也较强.制备牙鲆mPRL的多克隆抗体,采用Western blotting方法检测牙鲆mPRL蛋白在不同组织的表达特性,发现mPRL蛋白表达量在卵巢和脑组织中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,牙鲆mPRL蛋白在卵巢和脑组织的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.牙鲆mPRL在繁殖相关组织的表达特征说明其参与卵母细胞成熟的过程,并通过内分泌方式参与牙鲆的繁殖调控.     

基于原位LAMP技术的牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)易感宿主调查

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)给世界双壳贝类养殖业造成了严重的经济损失。10余种双壳贝类陆续被认定为易感宿主,仍有其他几种贝类仅有PCR核酸阳性数据,因确诊证据不足导致其易感性未得到充分评估。原位环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术相对传统原位杂交技术具有灵敏度高、方便快捷、可作为病原微生物感染证据的优点。为了在OsHV-1流行病学调查过程中实现病毒感染的快速检测和确诊,根据已报道的OsHV-1特异性LAMP检测引物,设计内引物,优化反应条件,建立了OsHV-1的原位LAMP检测方法。基于该方法对2019年以来采集的长牡蛎(Crassostrea gigas)、福建牡蛎(Crassostrea angulata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)样本进行检测。结果显示,毛蚶样本的OsHV-1原位LAMP检测结果呈阳性;其他几种贝类部分样本的实时定量PCR (qPCR)检测呈阳性,但原位LAMP检测呈阴性。对毛蚶样本的原位LAMP检测结果分析发现,病毒杂交信号主要分布在外套膜和肝胰腺等器官的结缔组织,推测感染的细胞为成纤维细胞和血淋巴细胞;在闭壳肌和斧足肌肉组织的肌细胞细胞核中也发现较多杂交信号。鳃丝内和周边偶现阳性信号,推测来自渗出的血淋巴细胞。基于原位LAMP技术的OsHV-1检测结果显示,毛蚶是OsHV-1的一种易感宿主,毛蚶结缔组织、肌肉组织和血淋巴细胞对该病毒有强亲嗜性。     

低氧预适应对魁蚶在低氧胁迫下生理生化指标的影响

本研究以未进行低氧预适应的魁蚶(Scapharca broughtonii)为对照组(C组),分析了2次低氧预适应(H2组)和4次低氧预适应(H4组)的魁蚶在溶解氧(DO)约为2.0 mg/L低氧胁迫48 h内的摄食、呼吸代谢和酶活力的变化规律。结果显示,3组魁蚶的摄食率(IR)在胁迫初期急剧下降,后期均随时间的延长逐渐恢复,至48 h时,H组恢复程度显著高于C组(P＜0.05＝;C组、H2组和H4组魁蚶的耗氧率(OR)随时间变化呈逐渐升高的趋势,48 h比0 h分别提高了1.15、1.08、0.73倍;3组排氨率(NR)表现出不同的变化趋势,至48 h时,C组、H2组和H4组分别为0 h的1.67、1.30、0.97倍;C组的氧氮比(O/N)相对平稳,H组的变化范围相对较大。3组的细胞色素C氧化酶(COX)随着低氧胁迫时间的延长呈逐渐降低的趋势,乳酸脱氢酶(LDH)活力和还原型谷胱甘肽酶(GSH)含量整体呈上升趋势,与对照组相比,预低氧组的酶活力在低氧胁迫期间变化相对平稳,应激反应小。研究表明,魁蚶经低氧预适应后再次受到低氧胁迫时,IR升高,OR降低,酶活性相对稳定,低氧预适应能提高魁蚶的耐低氧能力。本研究丰富了魁蚶低氧耐受相关研究的基础数据,为进一步探讨魁蚶低氧耐受机制和创制耐低氧新种质提供了参考资料。     

不同规格双齿围沙蚕对沉积物氮磷赋存形态影响分析

沉积物作为养殖系统中氮磷的蓄积库,对养殖水体氮磷水平调控发挥着重要作用,氮磷赋存形态影响其在沉积物中的吸附和释放。为研究双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)对海水养殖池塘沉积物氮磷赋存形态的影响,以400 g/m²生物量设计不同规格双齿围沙蚕养殖实验,分别为小规格[(0.7±0.3) g]、中规格[(2.5±0.3) g]和大规格[(4.3±0.3) g]处理组,不放养沙蚕设为对照组,实验周期为45 d,分别于实验初、末期采集不同深度的沉积物,测定其中氮磷各赋存形态的含量。结果显示,不同规格双齿围沙蚕均显著提高了沉积物上、中层离子交换态氮(IEF-N)、弱酸可浸取态氮(WAEF-N)和强碱可浸取态氮(SAEF-N)含量(P<0.05),中、小规格处理组显著降低了沉积物中强氧化剂可浸取态氮(SOEF-N)含量(P<0.05);不同规格双齿围沙蚕均显著提高了沉积物上、中层非磷灰石无机磷(NAIP)含量(P<0.05),中、小规格处理组显著降低了沉积物中有机磷(OP)含量(P<0.05)。本研究表明,中、小规格的双齿围沙蚕可以加速沉积物中有机氮磷的矿化,促进沉积物其他形态氮磷向上迁移,使其更容易分解和释放,进而被水体浮游植物所利用。     

凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的定量分析

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirAVp和PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pirAVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirAVp,其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值, 为8.71×104 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×103、2.59×104、5.76×104 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现VpAHPND的富集,在高死亡发生期,VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的VpAHPND均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的VpAHPND水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的VpAHPND数量呈下降趋势。研究表明,在VpAHPND感染过程中,组织中的pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。     

盐度胁迫对三疣梭子蟹“黄选1号”血清部分生化指标的影响

为探明三疣梭子蟹"黄选1号"在盐度胁迫过程中血清生化指标的变化规律及特点,进而了解盐度适应过程中能量代谢机制,设置5、10、20和50共4个盐度组,以自然海水(盐度30)为对照组,进行三疣梭子蟹"黄选1号"盐度胁迫实验。结果显示,实验组血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总蛋白(TP)含量总体表现为先降低后稳定并显著低于对照组,对照组血清GLU、TG和TP含量在0~72 h内基本稳定,在整个盐度胁迫过程中,实验组血清GLU、TG和TP含量达到基本稳定后表现为与对照组盐度差值越大其含量降幅越大的特点。同一实验组三疣梭子蟹血清GLU和TP含量的最大降幅比TG含量的最大降幅大。各实验组血清GLU含量在0~9 h迅速降低,而血清TG和TP含量迅速降低发生在0~12 h。血清TP含量的最大降幅在盐度20实验组,但低于血清GLU含量最大降幅,在盐度5、10、50实验组内血清TP含量最大降幅高于血清GLU含量最大降幅。实验组血清尿素(UREA)含量总体表现为先升高后稳定并显著高于对照组,与血清GLU、TG和TP含量的变化趋势相反。盐度5和50实验组血清UREA含量相近,而血清TP含量则在盐度10与50实验组内相近。研究表明,三疣梭子蟹血清中GLU、TG和TP均与渗透压调节密切相关,在盐度适应过程中血清GLU和TP是三疣梭子蟹渗透调节的主要供能物质且血清GLU首先代谢供能,不同盐度下三疣梭子蟹血清GLU与TP对渗透调节供能占比有所不同,高盐环境中三疣梭子蟹血清自由氨基酸含量的部分增加可能来源于其他组织。     

不同盐度下凡纳滨对虾生长和存活性状遗传评估

为揭示不同盐度环境对凡纳滨对虾家系体质量和存活性状的影响,本研究标记来自72个家系的4348尾对虾,在盐度30(HS组)和盐度15(LS组)条件下混养60 d,分析体质量和存活性状的遗传参数以及基因型与环境互作效应。结果显示,HS组的凡纳滨对虾平均体质量和存活率均高于LS组。估算体质量、存活性状遗传参数,结果显示HS和LS组体质量的遗传力估计值分别为0.51±0.08和0.30±0.07,属高遗传力;转换后存活性状遗传力估计值分别为0.22和0.39,也表现为中高遗传力水平。综合HS和LS组的数据,估算的体质量和转换后存活性状遗传力分别为0.45±0.07和0.31,均表现为高遗传力水平。然而由于收敛原因,在估计模型中未能包括共同环境效应,上述遗传参数估计值偏高。估算基因型与环境互作效应(G×E),结果显示两个盐度间体质量和存活性状均表现为高度遗传相关(0.81~0.90),G×E方差组分与加性遗传方差组分比值均小于0.5,G×E效应均不显著。研究表明,尽管凡纳滨对虾的生长和存活性状在两个盐度下存在一定差异,然而基因型与盐度的互作效应并不显著,由此认为在盐度15~30的范围内,不需要针对不同的盐度建立不同的选育系。     

虾夷扇贝动态能量收支生长模型

本研究旨在建立虾夷扇贝的动态能量收支(Dynamic Energy Budget,DEB)数值模型,为进一步构建北方海域虾夷扇贝养殖容量评估模型奠定基础。根据DEB理论,以水温和叶绿素浓度作为强制函数,基于现场及室内实验收集DEB模型参数,针对桑沟湾养殖环境和虾夷扇贝生长的数据,利用STELLA软件构建了虾夷扇贝的DEB模型,以长海县养殖环境和1龄、2龄、3龄虾夷扇贝生长的数据对模型进行验证。模型的模拟结果显示:(1)构建的DEB模型能够很好地模拟虾夷扇贝软体部干重的生长,反映了不同时间的能量分配情况;(2)在桑沟湾,6月1日至9月25日期间水温的限制性强于食物限制;在长海海域,9月15日至次年的6月20日期间食物的限制性强于水温的限制,由此推断,长海海域虾夷扇贝的养殖密度过大,可能超出了海域的养殖容量。另外,敏感性分析结果显示,能量分配系数k以及食物摄食能力参数–最大体表面积吸收率PAM、半饱和常数Xk,对虾夷扇贝生长模拟结果有着较大的影响,例如,PAM提高10%,生长模拟结果可增加13%。因此,这些敏感性较大的参数需要通过室内实验或者现场实验准确测定,谨慎赋值。